[发明专利]一种用于肿瘤基因干预的新型靶向复合物

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体的说是一种用于肿瘤等疾病生物靶向治疗的新型复合物。

背景技术

在本发明提出之前，应用于肿瘤生物治疗方面的药物已经有很多，如免疫刺激剂、抗体药物、基因干扰药物等等，但是都存在着各种各样的问题使得其效果并不明显，免疫刺激剂的使用容易引起免疫过度导致自身免疫疾病，抗体药物因为其外界蛋白的属性而引起的免疫反应很常见，基因干扰技术其疗效是值得肯定的，但是使用的载体却存在很大问题，严重的阻碍着基因干扰技术在临床疾病特别是肿瘤疾病中的使用。目前存在的主要的应用于临床疾病干预的基因干扰制剂包括裸小分子核糖核酸(siRNA)、胆固醇结合的siRNA、脂质体或者阳离子复合物结合的siRNA复合物以及抗体siRNA复合物等等，但是这些应用均有局限性，裸siRNA的使用只能在眼睛、呼吸道以及脊髓中属于局部使用，胆固醇结合的siRNA制剂的使用则是主要针对高血脂的治疗，脂质体或者阳离子复合物和siRNA的复合物没有特定细胞的靶向性，抗体和siRNA结合的使用受抗体免疫原性的限制，所以探讨一种新的靶向性强、安全的可以广泛使用的用于肿瘤等疾病治疗的RNAi载体势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于肿瘤基因干预的新型靶向复合物，以解决上述肿瘤治疗特别是肿瘤的生物靶向治疗中的难题。本发明设计人通过大量研究，提出和构建了一种基于核糖核酸干扰技术(RNAi)的新型肿瘤靶向治疗载体：即核酸适体-鱼精蛋白-小分子干扰核糖核酸复合物(aptamer-protamine-siRNA)，这种复合物的构成由三部分构成，本发明复合物的合成方式：将aptamer和siRNA按照摩尔比1∶1的比例用生理盐水或者磷酸盐缓冲液溶解，超声混匀，计算鱼精蛋白的摩尔数，其和aptamer以及siRNA的最佳摩尔比为1∶1∶1(可以使用的范围为[1～10]∶[1～10]∶[1～10])，溶解于生理盐水或者磷酸盐缓冲液，超声混匀促溶，然后将核酸混合液缓慢加入鱼精蛋白中，低速震荡混匀5min，室温静置20-30min，置于-20℃长期保存。其中鱼精蛋白起到桥梁作用，它具有结合核酸的功能，可以将另外两种核酸成分结合起来形成复合物，核酸适体具有识别靶向细胞表面特异性抗原的作用，而所携带的siRNA则可以起到沉默靶向基因的作用，所以该新型复合物可以靶向识别特定细胞(如肿瘤细胞)并且靶向沉默关键基因(如癌基因等)从而起到疾病(如肿瘤)治疗的作用。

应用本发明，该复合物可以用于肿瘤等疾病的生物靶向治疗，也可以应用于科学研究中siRNA进行基因干扰的研究。

本发明与现有的肿瘤生物靶向药物相比较，充分显示其创新点和优点为：①特异性和多重靶向性：aptamer高效靶向识别肿瘤细胞表面特异性抗原、siRNA特异沉默靶基因，其靶向性非常明确，不影响其他正常细胞的功能，只针对目的肿瘤细胞；不干预其他基因，只针对靶向基因；②安全性：该复合物为小分子纳米级制剂，鱼精蛋白是临床医学得以批准应用的小分子多肽，安全性得以保障；aptamer、siRNA是经过化学修饰的较稳定的小分子RNA制剂，降解和清除时间为3-4天，无毒副作用；③aptamer和siRNA都可以进行靶向性替换，针对不同肿瘤选用不同的表面抗原的aptamer(如针对乳腺癌中的erbB3、erbB2，前列腺癌的PMSA、宫颈癌的ScFv，直肠癌的CEA等肿瘤细胞特异性的细胞表面抗原的aptamer均适应本复合物)以及不同肿瘤关键基因的siRNA(如针对Ras、Jak、PI3k、c-myc、XIAP、survivin、livin、CDKs等在肿瘤生成以及肿瘤转移中其重要作用的基因的siRNA均适应于本复合物)。

附图说明

附图1：本发明复合物合成结构示意图；

附图2：通过荧光显微镜观察：vehicle组为生理盐水对照组，未看到有荧光表达；APFAMsiRNA组为加入了携带荧光siRNA的复合物组，可以看到有荧光表达，说明可以复合物进入到肿瘤细胞中；

附图3：通过流式细胞仪检测：荧光表达在APFAMsiRNA组表达明显高于vehicle生理盐水对照组；

附图4：通过荧光显微镜观察加入携带EGFP siRNA的复合物组，EGFP荧光表达的细胞较未加入的EGFP组明显减少，说明复合物可以起到干扰EGFP表达的作用；

附图5：流式细胞仪检测加入携带EGFP siRNA的复合物组细胞绿色荧光表达明显较单纯转染EGFP质粒组降低；