[发明专利]一种诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法

权利要求书

1.一种诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，包括以下步骤：

1）采集腋芽，进行消毒及萌芽；

2）生根诱导和白化苗诱导培养；

3）以白化苗的茎段切段为外植体进行诱导培养获得愈伤组织，该愈伤诱导培养基含有多胺；

4）将产生的愈伤组织分化出不定芽。

2.如权利要求1所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于：所述第1步骤是采集2-4年生桉树杂交品种的带腋芽茎段，经消毒处理后接种在MS培养基上萌发得到无菌芽；萌芽的培养条件是：温度22-30℃，无光照；所述消毒的方法是采用酒精和升汞消毒，再用无菌水冲洗。

3.如权利要求1所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于：第2步骤包括：

a）将第1步骤获得腋芽萌发芽转移到含0.1-2mg/L 细胞分裂素，0.01-1mg/L生长素的MS培养基上诱导产生丛生芽；

b）丛生芽中的健壮芽丛转移到含0.1-1mg/L 生长素的1/2MS培养基上诱导产生生根苗；

c）将生根苗切掉顶芽，接种在含蔗糖30-100g/L、NH₄NO₃ 1650-6000mg/L、KH₂PO₄ 170-800mg/L的MS培养基上，在黑暗中进行白化苗诱导培养。

4.如权利要求3所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于：第2步骤具体包括：

a）切取一定长度的腋芽，转移到含0.1-2mg/L 6-苄基嘌呤，0.01-1mg/L萘乙酸的MS培养基上，培养21-28天，光照12-18小时/天，光照强度1500-10000lx，温度22-30℃；

b）切取生长至一定长度的芽，转移到含0.1-1mg/L 3-吲哚丁酸的1/2MS培养基上进行生根诱导15-30天，光照12-18小时/天，光照强度1500-10000lx，温度22-30℃；

c）将生根苗切掉顶芽，保留根和基部的若干个腋芽，接种在含蔗糖30-100g/L、NH₄NO₃ 4500mg/L、KH₂PO₄ 500mg/L的MS培养基上进行白化苗诱导培养，暗培养14-35天，温度22-30℃。

5.如权利要求1所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于：所述第3步骤中，愈伤诱导培养基是含50-200mg/L腐胺、5-30mg/L亚精胺的MS培养基。

6.如权利要求5所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于：所述第3步骤中，愈伤诱导培养基进一步包含0.2-2mg/L 细胞分裂素、0.01-0.1mg/L生长素。

7.如权利要求6所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于：所述第3步骤具体包括：

a）以白化苗的茎段切段为外植体，接种在含0.05-0.3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，0.1-0.5mg/L 6-苄基嘌呤的MS培养基上进行细胞活化培养，暗培养0-6天，温度22-30℃；

b）活化后的外植体转移到含0.2-2mg/L N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲，0.01-0.1mg/L萘乙酸，50-200mg/L腐胺，5-30mg/L亚精胺的MS培养基上培养产生愈伤组织，暗培养5-7天，温度22-30℃；

c）转移到弱光照培养12-14天，光照12-18小时/天，光照强度20-200lx，22-30℃。

8.如权利要求1所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于：所述第4步骤是将第3步骤产生的愈伤组织转移到分化培养基上培养，使愈伤组织分化不定芽，所述的分化培养基是含有多胺的MS培养基。

9.如权利要求8所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于：所述第4步骤的分化培养基进一步包含0.2-2mg/L 细胞分裂素、0.05-0.5mg/L生长素。

10.如权利要求9所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于：所述第4步骤具体包括：

a）将获得的愈伤组织，转移到含0.2-2mg/L 6-苄基嘌呤，0.05-0.5mg/L萘乙酸，10-40mg/L腐胺，0.5-3mg/L亚精胺的MS培养基上，每隔14-25天转移到相同的分化培养基上继代培养，光照12-18小时/天，光照强度500-3000lx，温度22-30℃；

b）在分化培养基上继代培养14-100天产生不定芽。