[发明专利]基因NS1缺陷型呼吸道合胞病毒及其治疗肺癌的应用

说明书

技术领域

本发明涉及呼吸道合胞病毒(RSV)，具体地说是一种基因NS1缺陷型呼吸道合胞病毒(ΔNSI RSV)及其治疗肺癌的应用。 

背景技术

肺癌根据组织病理学可以可分为小细胞肺癌(～15％)和非小细胞肺癌(NSCLC，～85％)。2009年仅美国新增大约219，440病人，159，390人死于肺癌.目前还没有有效的治疗手段，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)对化疗有抗药性。放射疗法，或者结合化疗，手术对治疗NSCLC有一定的帮助。但是肿瘤抗放射性，包括治疗前以及治疗阶段过程中的内在的肿瘤抗放射性是放疗的一大难题。目前还没有更好的治疗恶化或转移性的NSCLC。 

呼吸道合胞病毒包含大约10个不同的基因，成线行排列。目前，尚无运用基因工程改造的呼吸道合胞病毒来治疗肺癌的报导。 

发明内容

所要解决的技术问题：本发明目的是提供一种通过基因工程改造的呼吸道合胞病毒用于治疗肺癌。 

技术方案：一种基因NS1缺陷型呼吸道合胞病毒，其特征是所述基因NS1缺陷型呼吸道合胞病毒是用Vero细胞合成、Vero细胞经用携带有NS1-缺陷病毒cDNA、病毒N，M2-1，P和L基因的质粒共转染而形成。 

所述基因NS1缺陷型呼吸道合胞病毒，是用反向基因策略删除呼吸道合胞病毒中的基因NS1。 

所述基因NS1缺陷型呼吸道合胞病毒应用，是应用于治疗肺癌，杀伤肺癌细胞。 

所述经过基因工程改造的呼吸道合胞病毒可为其他病毒，所说的其他病毒带有类似RSV NS1基因，该基因被删除，从而具有杀伤癌症的效果。 

本发明有如下显著效果： 

1、本发明基于杀瘤病毒疗法.该发明中，呼吸道合胞病毒的NS1基因被删除，改良后的该病毒只杀死癌症细胞，而对正常细胞没有任何影响。本发明创造性地删除NS1基因，生成的N S 1基因缺陷呼吸道合胞病毒(ΔNS1 RSV)具有选择性杀伤癌症细胞，而不影响正常细胞。本发明特点之一为反向基因策略(逆向分子生物学方法)去除NS1基因(病毒正链RNA上122到630碱基序列).ΔNS1 RSV营救则通过用携带有NS1-缺陷病毒cDNA，病毒N，M2-1，P和L基因的质粒共转染Vero细胞。呼吸道合胞病毒NS1蛋白为一型IFN拮抗剂，而ΔNS1 RSV感染肿瘤组织局部能生成更多的IFN，从而阻止病毒在正常细胞中的复制，但并不影响病毒杀伤肿瘤细胞，从而选择性地抗肿瘤。 

2、呼吸道合胞病毒包含大约10个不同的基因，成线行排列。在启动子附近的基因转录的几率大于远端的基因。NS1基因位于靠近于启动子，在基因全序列的3’端.因此他的mRNA转录最多，而且成启动-中止-再启动的模式。蛋白不存在呼吸道合胞病毒的颗粒中而只见于受感染细胞故被称为非结构蛋白.研究证实，NS1能阻断一型干扰素信号通路，表明NS1能直接抑制宿主的免疫放应。所谓杀瘤病毒疗法，是通过基因工程改良病毒，选择性地杀死癌细胞，而保护正常组织不受伤害，从而达到治疗肿瘤的目的。杀瘤病毒在肿瘤细胞中不断地复制，从而致使癌细胞裂解，或者诱导癌症细胞凋亡。NS1基因去除后的改良型呼吸道合胞病毒，具有这样的功能。 

3、本发明也可以通过其他的方式，去除NS1基因，从而实现类似的功能.在临床治疗上，可以通过静脉注射基因工程的NS1基因缺陷呼吸道合胞病毒，或直接肿瘤局部运用该病毒，达到治疗的效果. 

4、本发明特别是对治疗肺癌具有很好的效果，细胞丧失正常的凋亡途径就可能发展成癌症.本发明人事科的研究发现NS1缺陷RSV(ΔNS1 RSV)可以选择性地诱导A549肺肿瘤细胞产生凋亡，同时降低线粒体ΔΨm值和促进线粒体肿胀，提示ΔNS1 RSV通过线粒体介道的细胞凋亡途径杀伤 肿瘤细胞。 

附图说明

图1是呼吸道合胞病毒的基因序列。 

图2是免疫印迹确定病毒NS1蛋白。 

图3之A、B是病毒感染NSCLC及正常细胞，A是感染后24小时A549细胞和WI-38细胞形状的变化。B是感染20小时后病毒滴度空斑实验。 

图3之C、D、E、F，其中，C、D为BALB/c裸鼠皮下注射A549癌细胞并进行病毒治疗，对照鼠注射等量的悬浮病毒溶剂，治疗后对肿瘤大小测量，每个数据为平均数±标准误。其中，E、F为治疗3天后，取肿瘤和其他组织器官，均浆.病毒滴度用和总RNAs用RT-PCR测量F基因表达定量。