[发明专利]多环芳烃好氧降解菌的富集筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于受污染土壤与水的生物修复技术领域，具体地说，涉及多环芳烃好氧降解菌的快速富集、筛选方法。

背景技术

多环芳烃(PAHs)是指两个或两个以上苯环连在一起构成的烃类化合物，其中许多种类具有致癌、致畸、致突变作用，而且其毒性和致癌性随着苯环数目的增加而增加。由于PAHs分子中存在共扼大π键电子体系，具有较高的稳定性，而成为环境中持久性污染物。

环境中PAHs主要来源于人类活动，如石油冶炼、运输业、煤气制造等。由于石油及石油产品的大量使用，环境中多环芳烃有不断增多的趋势，而且分布广泛，在大气、水体、土壤、沉积物和食品中都检测到多种PAHs的存在。

环境中的PAHs主要依靠微生物的降解作用去除，而PAHs的好氧生物降解比厌氧生物降解的速率要快很多倍，因此，筛选出高效好氧降解菌是多环芳烃污染土壤生物修复技术的一个关键。

目前常用的筛选方法是液体摇瓶培养法，其是在无机盐液体培养基中添加固体或有机溶剂溶解的多环芳烃，然后接入土壤等菌源，摇床培养，富集并筛选多环芳烃降解菌。例如，Singleton等人在无机盐培养基中加入菲，摇瓶培养后平板稀释，从而得到菲降解菌(Appliedand Environmental Microbiology，75(9)：2613-2620，2009)。

但是，由于四环及其以上的多环芳烃的分子量大、疏水性强、水溶性低，因此目前常用的摇瓶培养法仅适合于筛选三环及三环以下多环芳烃的降解菌，而对于四环及其以上多环芳烃的降解微生物的筛选，会出现周期长、筛出机率小，筛出的降解菌系稳定性差、降解率不高等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多环芳烃好氧降解菌的富集筛选方法，该方法筛选时间短，更易得到高效降解菌系和降解菌，特别适合于筛选四环及其以上多环芳烃的降解菌。

为了实现上述目的，本发明的多环芳烃好氧降解菌的富集、筛选方法包括1)制备多环芳烃降解菌系、2)筛选多环芳烃降解菌及3)对纯化的降解菌进行复筛三个步骤，其中，所述步骤1)是在无机盐培养基中加入水稻秸秆和滤纸，高温蒸气灭菌后，再加入多环芳烃；以受多环芳烃污染的土壤为菌源，将其接入上述培养基中，摇床避光培养至培养液变为深棕色；将上述培养液进行传代培养，每次传代培养时培养基中水稻秸秆的加入量均比上一代减少，且不再添加滤纸，每次传代培养均以培养液变为深棕色为传代标准，传代培养在五代以上，最后一代培养时培养基中不再添加水稻秸秆。

其中，所述多环芳烃包括芘或荧蒽，或其他四环以上多环芳烃；多环芳烃的加入量是使其终浓度为200mg/L。

所述水稻秸秆的加入量为无机盐培养基重量的0.3～0.5％，传代培养时水稻秸秆的加入量均比上一代减少1/3；所述滤纸为5cm×1cm的滤纸条。

所述菌源是将受多环芳烃污染的土壤制成浓度为12.5g/mL的菌悬液，并按培养液体积的5～10％接种；所述摇床避光培养的条件为：温度28～30℃、转速150rpm、培养时间为14～21天。

此外，步骤2)筛选多环芳烃降解菌用本领域常用方法即可，例如按如下方法进行筛选：

在无机盐培养基中加入琼脂，高温蒸气灭菌后，倒于平板上，待培养基凝固后，加入步骤1)中所述多环芳烃的丙酮溶液，分布均匀后静置使丙酮挥发；将步骤1)制得的多环芳烃降解菌系培养液经梯度稀释后涂布于上述平板上，30℃温度下培养7～14天；挑取周围有透明圈的菌落，接种于新的上述固体平板上划线分离，得到纯化的降解菌。

其中，所述琼脂的添加量为无机盐培养基重量的1.5～2％；所述多环芳烃的丙酮溶液的浓度为5g/L；所述无机盐培养基与多环芳烃的丙酮溶液的体积比为50～100∶1；所述梯度稀释是将上述多环芳烃降解菌系培养液按体积分别稀释10³、10⁴、10⁵倍。

此外，步骤3)对纯化的降解菌进行复筛使用本领域常用方法即可，也可以使用如下方法进行复筛：

所述步骤3)是将步骤2)得到的降解菌接种于LB平板培养基中，长出菌落后，制成浓度为OD₆₀₀＝1的菌液，备用；在血清瓶中加入上述多环芳烃的丙酮溶液，待丙酮挥发后，加入无机盐培养基，将上述菌液接入血清瓶中，30℃温度下避光摇床培养7～14天；用高效液相色谱(HPLC)方法测定剩余的多环芳烃，计算降解率，选取降解率在90％以上的菌株。

其中，所述菌液按本领域常用方法制备即可，如将菌种刮于含玻璃珠的无菌水中，将菌打散形成菌液。