[发明专利]用于免疫测定的增强标记缀合物

说明书

技术领域

本发明涉及免疫测定领域，特别是由至少一个载体和至少一个连接体组成的，用于诊断测定的被标记的缀合物。

背景技术

许多测定使用了被标记的试剂，也被称为检测缀合物，提供的每种标记使得可以定性或定量的测定每种特定试剂的存在。标记的重要原理是基于颜色、发光、如化学发光和荧光、放射性、以及磁性。通常优选荧光标记，因为此标记可以并且易于快速测光读数。放射性标记有可以给出定性和定量读数的优势，但最近和当今的趋势通常偏向非放射性标记。

有三个重要因素决定使用检测缀合物的测定的灵敏度。这些因素是连接到试剂，如抗体上的标记物的数量；检测缀合物的亲和力，如每个缀合物的抗体数量；以及检测缀合物在结合点的浓度，即可能发生的连接事件的数量。已经使用掺入或标记了大量标记物的聚合颗粒来增强灵敏度。

已知的增加标记的方法是将更多标记物连接到颗粒上，并将连接体，如抗体连接到这些被标记的颗粒上。

合成的聚合物颗粒，如聚苯乙烯颗粒，有不同的大小可供使用。现在使用的被掺入聚苯乙烯颗粒的荧光基团或发色基团直径最通常是大于100nm。

例如能通过使用适合的、展示出可以标记的氨基的蛋白包被颗粒的方法来改进向颗粒连接标记物。给出以下的例子：甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白、血青蛋白、肌浆球蛋白、脱铁铁蛋白、过氧化氢酶、一系列有不同赖氨酸/氨基酸比率的聚赖氨酸共聚物、α-2-巨球蛋白、亮氨酸氨肽酶、重酶解肌球蛋白和组蛋白。

这种方法在许多情况下是成功的，但也引起了不精确性的问题。后者的另一个问题是由于测定中可以加入的颗粒数量有限，结合点处的连接事件数量少。在实际应用中，在连接到被捕获在固相上的抗原上时，一个颗粒标记被认为等于一个连接体，如抗体。进一步的，流动测定时的强剪应力也可能影响连接和形成的夹心结构的稳定性。

US 5,891,741涉及与右旋糖苷交联的，抗体-藻胆蛋白缀合物，缀合物中每个右旋糖苷分子包含多至12个藻蛋蛋白。公开的内容提及术语“单分散性”，但其仅是与藻胆蛋白家族中的一个成员，藻红蛋白有关。US 5,891,741中使用的载体是右旋糖苷，如前所述是多分散性的。

CA 1330061公开了一种包括与载体颗粒相连的抗生物素蛋白或链霉亲和素的检测缀合物，其中载体颗粒表面包含多于15个能用适合操作的标记物独立标记的氨基。载体颗粒可以与抗生物素蛋白或链霉亲和素相连形成检测缀合物。

US 20050026305A1涉及大小分布窄的多分散性氨基右旋糖苷聚合物分子，以及其作为流式细胞术的细胞标记试剂的用途。

出于实用性原因，当使用已有技术中的，如CA 1330061和US20050026305A1中举出的被标记的颗粒时，颗粒在溶液中的浓度一定会受到限制。

因此，已有技术中的一个问题是怎样提供一种在更高的浓度下可用的缀合物。

Qin等(Anal Chem.2001 Apr 1；73(7)：1521-9)公开了两种用作高灵敏度免疫测定通用检测试剂的，基于链霉亲和素的高荧光检测缀合物。直接缀合物是通过将链霉亲和素共价连接到被大量铕螯合物标记的聚(谷氨酸：赖氨酸)上制备而成；而间接缀合物的制备是首先将牛血清白蛋白(BSA)缀合到被大量铕螯合物标记的聚(谷氨酸：赖氨酸)上，随后进一步将链霉亲和素连接到BSA-聚(谷氨酸：赖氨酸)-铕螯合物缀合物上。直接缀合物和间接缀合物都被用于构建高灵敏度的时间分辨前列腺特异性抗原(PSA)荧光测定。使用直接缀合物的测定灵敏度是使用间接缀合物的测定的1.5倍。当使用45微升样品体积时，使用直接缀合物得到了0.001微克/L的检出限。然而由于聚合物的准确大小难以控制，因此，Qin等的缀合物并不适合实际使用。在实践中，聚(谷氨酸：赖氨酸)聚合物分子量分布在很大的范围内。

现有技术的另一个问题是使用多分散聚合物的效果。进一步的问题还有每个检测缀合物连接体数量少和连接亲和力低。

US 20060008206涉及一种波导板及其生产过程，和包括这样的波导板的微量滴定板。

WO 2008/0733222公开了间接侧向流动夹心测定，其中目标分析物被连接到包含缀合对的第一成员的分析物特异性试剂上，形成复合物，复合物联系并连接包括所述缀合对的另一成员的，一个有色的颗粒状标记物，形成第二复合物。通过固定的被分析物特异性捕获试剂捕获包含被分析物的第二复合物，结果形成了可以被检测到的，被标记的固定夹心复合物。

发明简述

本发明的目的是消除至少一部分现有技术的缺点并提供一种改良的缀合物。