[发明专利]猪基因组中外源基因整合位点的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及外源基因整合位点的检测方法。

背景技术

人们将所需要的外源目的基因通过质粒或逆转录病毒等载体导入宿主细胞中，使得外源基因与宿主基因组稳定的整合在一起，其即可随宿主基因组的复制而扩增，又能在体内得到表达，并能稳定地遗传给后代，这种携带外源基因的动物被称为转基因动物。转基因动物所有的细胞都应整合有外源基因，且能将外源基因遗传给子代，如果外源基因只整合入动物的部分细胞或组织器官的基因组，则称为嵌合体。整合入宿主基因组的目的基因称为外源基因或转（植）基因（安晓荣，2001）。经过近四十年的发展，人们相继成功培育了携带有不同外源基因的转基因兔、羊、猪、牛、鱼、鸡、小鼠、大鼠等转基因动物。目前，转基因技术已成为当今生命科学的一个发展最快、最热门的学科，其在功能基因组研究、定向育种、转基因生物反应器、建立人类疾病模型等方面都发挥了巨大作用。

外源基因整合入受体基因组后，整合一般具有稳定性，大部分以孟德尔方式遗传给后代，但有时外源基因未整合到染色体上，而是以附加体形式存在，不稳定；目前认为基因表达的强弱与整合的拷贝数无关，而与整合位置有关；整合也可能会引起外源基因位点的侧翼序列发生重排、缺失、重复或异位现象；外源基因的整合可能会造成宿主细胞基因突变出现新表现型，也可能会中断宿主细胞一些必须基因的转录过程，或激活有害基因，导致胚胎畸形或死亡。一般认为，外源基因的整合位点对其表达水平有着至关重要的影响，有时同样一个外源基因可在一定的整合位点正常表达，而在另一些位点不表达或低水平表达（王继英，2002）。因此，外源基因整合位点的检测是对后续研究和探讨外源基因表型和功能以及选择适当的个体扩群十分重要的。

实验证明，外源基因整合到宿主基因组大多发生在DNA复制的S期，可能以单位点或多位点的形式随机地插入受体基因组中的任意位置，因而存在“有效整合”、“沉默整合”和“毒性整合”三种整合状态，其表达水平也非均一（吴波，2003）。目前，外源基因整合位点具有位置效应已被公认。用人β-球蛋白基因进行转基因小鼠的研究结果表明，不同转基因小鼠中外源基因所整合的染色体位点不同，在这些不同的转基因小鼠中，所整合的外源基因有的表达活性很低，有的则根本无表达，其中只有当β-球蛋白基因整合在小鼠第3号染色体上时，才可在转基因小鼠的骨骼肌中表达。其它转基因动物如转基因鱼、转基因羊和转基因牛中外源基因的整合与表达也有类似现象。这种位置效应不仅影响外源基因的表达水平，而且也影响外源基因的发育模式，以致在具有同一外源基因但不同整合位点的转基因小鼠中，外源基因的转录在不同时期和不同组织中被激活。还有研究表明，如果外源基因整合位点位于异染色质区（如LINE序列），其表达会被抑制或完全沉默；但如果外源基因整合位点位于转录活跃的染色质区（如小鼠中的Rosa26区），其也会广泛且高水平的表达。

目前，猪基因组测序已经完成，猪基因组中共有19对染色体，大约2.7亿个碱基，里面包含大约3万多个基因，如何在基因组中找到能够适合外源基因稳定整合的位点是目前研究的重点。

转基因克隆技术就是将核移植技术与转基因技术相结合来生产转基因动物，首先将外源基因导入到供体细胞中，然后筛选择阳性的细胞作为核供体做核移植，如此获得动物即为转基因克隆动物。1997年2月，Wilmut等利用核移植技术获得世界上首例成年体细胞克隆绵羊——“Dolly”，同年又利用转基因克隆技术获得世界首例体细胞核移植转基因克隆绵羊——“Polly”。目前，国外通过体细胞核移植技术路线已经获得了表达多种基因的转基因牛（Cibelli,1998;WallRJ,2005）、羊（SchniekeAE,1997；McCreathKJ,2000）和猪（Lai,2002;DaiY,2002;PhelpsCJ,2003;Hao,Y.H,2006）等。国内也通过该技术路线获得了转基因山羊（王海等，2004）和转基因牛（龚国春等，2003）。2006年10月，刘忠华等获得国内首例成体体细胞克隆猪，同年12月刘忠华等又获得国内第一例绿色荧光蛋白转基因克隆猪，这标着我国转基因克隆技术也已达到国际水平。

外源基因整合入基因组后，需要对外源基因的整合位点进行鉴定，检测外源基因的基本方法是通过分子生物学和细胞生物学的方法对外源基因序列进行检测，分析外源基因的整合状况（汤家铭，2002）。该方法操作复杂，人为误差大，检测结果不够准确。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有外源基因整合位点的检测方法操作复杂，误差较大的问题，而提供了猪基因组中外源基因整合位点的检测方法。