[发明专利]一种含有OATP1B1启动子和报告基因的重组质粒及筛选OATP1B1诱导剂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过激活孕烷受体(PXR)来调节其下游靶基因有机阴离子转运体1B1表达的诱导剂筛选方法。

本发明还涉及含荧光报告基因的质粒。

背景技术

肝脏是生物转化解毒的主要器官，在肝脏中存在多种类型的药物转运体，对于药物的吸收、分布和排泄起重要作用，如多药耐药相关蛋白，乳腺癌耐药蛋白，有机阴离子转运多肽家族等。OATP1B1是有机阴离子转运多肽家族中最为重要的成员，OATP1B1的编码基因SLCO1B1不仅具有高度多态性，且已发现多个具有功能意义的突变型。目前已研究证实，OATP1B1除靶向转运非结合型胆红素、胆汁酸、甲状腺激素等多种内源性物质外，还介导多种具有重要临床意义药物的肝脏跨膜转运，如抗恶性肿瘤药(伊立替康、甲氨喋呤)、调血脂药(普伐他汀、阿托伐他汀、匹伐他汀、罗苏伐他汀、西伐他汀)、抗高血压药(缬沙坦、奥美沙坦、波生坦)、抗高血糖药(瑞格列奈、那格列奈)。OATP1B1功能增强(如被诱导)时，转运底物的能力提高，进入肝细胞的底物数量增加；反之，OATP1B1功能降低(如某些位点的基因突变)时，进入肝细胞内的底物减少。因此OATP1B1功能改变不仅与胆红素血症有密切联系，而且与药物的疗效和毒副作用紧密相关。全基因组关联研究(Genome-wide Association Study，GWAS)表明OATP1B1功能缺陷的*5/*5基因突变者，转运辛伐他汀进入肝细胞的功能降低，致使辛伐他汀转运进肝细胞的数量减少、血浆药物浓度过高，致使其降脂疗效减弱而导致肌病等不良反应增加。因此，研究药物对OATP1B1的诱导作用对于胆红素血症治疗以及药物安全合理应用有着重要的意义，见下表。

OATP1B1转运药物的毒副反应及解决方案等相关信息

原代培养的人肝细胞模型是经典的体外酶、转运体诱导研究模型。然而，人肝细胞模型受到伦理道德、组织来源、培养条件、无法做到高通量等众多限制，在实际研究中很少采用。因此，发明一种原材料易获得、操作简便、成本低廉、可实现高通量筛选的新方法应用在OATP1B1诱导剂的开发研究中显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种高通量筛选OATP1B1诱导剂的方法.

本发明的另一目的是提供一种含有OATP1B1基因启动子(-128to-111和-9957to-9940)和报告基因的重组质粒。

本发明首先提供一种含有OATP1B1启动子和报告基因的重组质粒，所说的OATP1B1的启动子区域是-128to-111和-9957to-9940。

其中本发明所述的含有OATP1B1基因启动子和报告基因的重组质粒中所述报告基因可以为萤火虫荧光素酶基因，氯霉素乙酰转移酶、碱性磷酸化酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白、β-内酰胺酶等。每种荧光素酶都可以通过商业途径获得，也都各自有其特点。但总的来说，由于萤火虫荧光素酶检测灵敏度高，检测容易等特点是目前最常用的作为启动子研究的报告基因。

制备重组质粒的方法是已知的，例如由美国冷泉港实验室出版社的《分子克隆实验指南》详细论述了重组质粒的制备方法。

本发明利用上面获得的重组质粒，通过以下方法来实现的筛选化合物的，包括如下步骤：

第一步：将前述获得的含有OATP1B1启动子和报告基因的重组质粒、PXR表达质粒、以及内参质粒海肾荧光素酶共转染至人肝癌细胞株HepG2细胞中；

第二步：加入待筛选的可能具有激活PXR调节OATP1B1基因表达的化合物；

第三步：采用化学发光检测报告基因的表达以及海肾荧光素酶荧光，以二者的比值来反映不同的待筛选化合物对OATP1B1基因表达的影响。