[发明专利]一种抑血管生成素、纯化方法及含有它们的药物组合物

权利要求书

1.一种抑血管生成素，其特征在于，其氨基酸序列选自SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2，具有用非还原性SDS-PAGE法测定的25000～35000道尔顿之间的分子量，具有抑血管生成活性。

2.如权利要求1所述的抑血管生成素，其特征在于，采用还原性SDS-PAGE法测定显示为两条带，分别称α链和β链，分子量分别为12000～22000道尔顿、9000～19000道尔顿，其中，α链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求2所述的抑血管生成素，其特征在于，经双向电泳后会分别产生与所述α链和β链对应的异构体各三个。

4.如权利要求1所述的抑血管生成素，其特征在于，其与杂交瘤细胞株1D9，保藏号CCTCC C200970，分泌的单克隆抗体特异性结合，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的主要抗性为与抑血管生成素特异性结合。

5.如权利要求1所述的抑血管生成素，其特征在于，其能够抑制肿瘤生长。

6.如权利要求5所述的抑血管生成素，其特征在于，所述肿瘤选自人的黑色素瘤、Hela细胞以及K562细胞。

7.如权利里要求1至6任一项所述的抑血管生成素的纯化方法，包括如下步骤：

(a)将尖吻蝮蛇粗毒溶解于缓冲液中，其中蛇毒与缓冲液的体积比为1～2∶10，离心得到上清液；

(b)将所得上清液过二乙胺乙基阴离子交换层析柱进行层析，得到抑血管生成素粗溶液；

(c)将杂交瘤细胞株1D9，保藏号CCTCC C200970，分泌的单克隆抗体与亲和层析载体偶联，制备得免疫亲和层析柱；

(d)用所得免疫亲和层析柱纯化步骤(b)所得抑血管生成素粗溶液，以洗脱缓冲液洗脱，收集得到所述抑血管生成素。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述缓冲液为pH 7.0～9.0的0.01～0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述尖吻蝮蛇粗毒离心2次，离心速度为4000r/min，每次离心15min。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(b)所述层析pH 6.0～9.0的0.01～0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液和0.05～0.6mol/L NaCl溶液作为洗脱液进行线性梯度洗脱，洗脱时间为1440min，洗脱流速5ml/min。

11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(c)所述亲和层析柱载体为4B琼脂糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶、羧甲基葡聚糖凝胶中的任意一种。

12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(d)所述洗脱缓冲液为pH2.0～4.0、0.01～0.03mol/L的Gly-HCl缓冲液。

13.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1的抑血管生成素，并含有药学可接受的载体。

14.一种注射剂，其特征在于，含有权利要求1的抑血管生成素和药学可接受的赋形剂、稳定剂。

15.如权利要求14所述的注射剂，其特征在于，每毫升所述注射剂含有至少1mg的抑血管生成素。

16.如权利要求14或15任一项所述的注射剂，其特征在于，每毫升所述注射剂包含抑血管生成素至少1mg、右旋糖酐32～48mg、海藻糖1.6～2.4mg。