[发明专利]非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗及应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。本发明涉及一种非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗及其构建方法，同时涉及该疫苗在预防猪瘟和乙型脑炎中的应用。

技术背景

猪瘟是猪的一种传染性极强的病毒性疾病，早期称为猪霍乱(Hog Cholera，HC)，可感染各年龄阶段猪，一年四季流行，发病率和死亡率均很高，危害巨大。猪瘟的病原体是猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)，在国际兽疫局(OIE)制定的《国际动物卫生法典》中，猪瘟被列入A类16种法定报告的传染病之一。我国近年来猪瘟频繁爆发流行，给养猪业造成了严重经济损失，妨碍了畜牧业的发展和出口贸易，提高对猪瘟的预防和控制水平是科技工作的重大课题。

CSFV基因组长为约12.3kb的单股正链RNA，由5′端非编码区(5′Untranstaledregion，5′UTR)、一个大的开放阅读框架(ORF)和3′端非编码区(3′UTR)构成。ORF编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，多聚蛋白在翻译过程中或翻译后，被病毒自身编码的蛋白酶和宿主细胞的蛋白酶加工成12种成熟蛋白质，包括4种结构蛋白C、E^rns、E1、E2和8种非结构蛋白N^pro、P7、NS2、NS3、NS4A、S4B、NS5A和NS5B。其中，E2蛋白是CSFV的跨膜糖蛋白，介导病毒的吸附与入侵，是CSFV毒力相关因子和保护性抗原蛋白之一。CSFV感染机体能诱导机体产生高滴度E2抗体。E2常以同源二聚体或E1E2异源二聚体存在于病毒粒子和宿主细胞的表面；E2与下游的P7蛋白有时加工切割不完全，在CSFV感染的细胞中可以发现E2p7这种稳定的中间体。

早在1951年，我国研究人员筛选出免疫原性优良的CSFV石门毒株(殷震，1997)，该毒株作为中国CSFV标准强毒株沿用至今。当时使用CSFV石门毒株，灭活制成猪瘟结晶紫甘油灭活疫苗，使用后迅速控制了国内的猪瘟疫情。1954-1956年间，中国兽药监察所等单位的研究人员将CSFV强毒株(其中包括标准强毒石门株)适应家兔，在兔体连续传代，选育出一株对猪基本无毒力，并保持CSFV免疫原性的兔化毒株，即中国猪瘟兔化弱毒疫苗株(hog cholera lapinized vaccine，HCLV)。猪瘟兔化弱毒疫苗的成功研制和应用，对我国猪瘟的预防和控制起了决定性作用。然而，近50年来猪瘟兔化弱毒疫苗的广泛使用，并未控制猪瘟的发生。近年来，我国猪瘟的发生出现了许多新特点，表现为从频发的大流行转变为无规律的散发流行；临床症状从典型变为非典型猪瘟，病毒毒力降低，病程由急性、亚急性转变为以慢性为主，出现持续感染、胎盘感染、母猪繁殖障碍以及新生仔猪的先天性感染等。尽管疫苗的免疫剂量和免疫次数增加，仍不能控制猪瘟的发生，而且呈蔓延趋势。其中，猪瘟兔化弱毒疫苗接种与CSFV野毒感染猪不能用血清学检测方法相区分，无法剔除CSFV野毒感染猪，一旦发生感染，病毒长期存在，是导致猪瘟散发流行的主要原因之一。猪瘟的发生、传播和流行是严重制约我国养猪业健康发展、增加农民收入和发展国际贸易的瓶颈。为满足我国对猪瘟预防、控制和最终根除的需要，研制新一代猪瘟疫苗制品以替代传统的猪瘟兔化弱毒疫苗，势在必行。

流行性乙型脑炎，又称日本脑炎(Japanese encephalitis，JE)，是一种自然疫源性人畜共患的急性传染病，由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染引起，通过蚊为媒介传播，以高热和狂暴或沉郁等中枢神经症状为特征。JEV与CSFV同属黄病毒科成员，其基因组为约11kb大小的单股正链RNA分子，由5′端非编码区、大的开发阅读框(ORF)和3′端非编码区组成。ORF  依次编码C-PreM-M-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5等11种蛋白质。其中，E蛋白是JEV的主要结构蛋白，由500个氨基酸组成，它在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。早期研究结果表明，E蛋白的保护性抗原表位集中在蛋白质结构域III的氨基酸序列内(位于E蛋白第292-402位氨基酸)[Virology，1999，26：31-42；Vaccinc，2003，21：2516-2522]。