[发明专利]人二倍体细胞狂犬病疫苗毒种及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是利用人二倍体细胞(KMB17)生产用于预防人类狂犬病的疫苗毒种及其制备方法。 

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种疾病，一旦发病，100％死亡。我国近年来狂犬病疫情持续上升，发病率现居世界第二位，仅次于印度，狂犬病病死人数居37种法定报告传染病之首。狂犬病至今无法治愈但可有效预防，因此我国狂犬病的预防工作就显得尤为重要。 

目前世界用于生产狂犬病疫苗的培养基质细胞主要有地鼠肾细胞、鸡胚细胞和非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)等动物源性细胞。动物源性原代细胞不能排除细菌、病毒、寄生虫等外源致病因子的污染，且有生产规模不易扩大、环保难解决等缺点；而Vero细胞由于是传代细胞系，有一定的致瘤性，疫苗中细胞残余DNA必须达到标准，而且其最大的缺点是该细胞株没有我国自主知识产权。人二倍体细胞为人源性正常核型细胞，无致癌性，无异种DNA，其安全性无疑要高于动物源性细胞。目前我国使用的狂犬病疫苗种类虽多，但质量良莠不齐，至今尚无被WHO、FDA等组织肯定和推荐的人二倍体细胞培养疫苗，而基本是用地鼠肾细胞、Vero细胞和鸡胚细胞等动物源性细胞培养的疫苗。国外生产的人二倍体细胞狂犬病疫苗，如美国Wyeth厂、法国Merieux研究所和德国Behring厂生产的二倍体疫苗，已证实其具有良好的免疫原性和安全性，但用人二倍体细胞培养狂犬病毒，有病毒滴度相对较低、疫苗成本高及价格昂贵等缺点，难以广泛使用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种具有我国自主知识产权，适应于人二倍体细胞(KMB17)，具有良好免疫原性和传代稳定性，并且易于大量扩增的狂犬病疫苗 毒种及其制备方法。用该毒种生产人二倍体细胞(KMB17)狂犬病疫苗，将进一步提高我国狂犬病疫苗的安全性和实用性，以便能更安全、有效地预防人类狂犬病。 

1984年WHO第7次狂犬病专家委员会将CTN-1V₅株认可为狂犬病毒固定株，列为可用于生产疫苗的病毒株。本发明是将狂犬病固定毒CTN-1V₅株连续在人二倍体细胞(KMB17)中传代，以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，再经连续传代，获得适应于人二倍体细胞(KMB17)并具有良好免疫原性和传代稳定性的狂犬病毒株，培育出在人二倍体细胞(KMB17)高效增殖的狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)，该狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)，分类命名为狂犬病毒Rabies virus，已于2010年07月16日保藏于中国微生物生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.3989。 

CTN-1V₅株经过在人二倍体细胞(KMB17)中传代适应，其病毒滴度由第1代的4.5lgLD50/ml逐渐升高，到20代时病毒滴度≥6.9lgLD50/ml，经进一步筛选后，传代至47代，病毒滴度基本稳定在7.0lgLD50/ml以上。 

本发明的人二倍体细胞(KMB17)的培养扩增是在细胞营养液中进行的，细胞营养液由Eagle液、乳蛋白及一定量的新生牛血清组成。 

具体制备方法步骤如下： 

1、用由Eagle液、乳蛋白及2％～15％的新生牛血清组成的细胞营养液，于35℃～37℃培养扩增人二倍体细胞(KMB17)。 

2、将狂犬病固定毒CTN-1V₅株在人二倍体细胞(KMB17)中传代，收获所得病毒命名为CTN-DK株。传代方法为当细胞长成致密单层后，用胰酶-EDTA消化，收集细胞，将CTN-1V₅株按0.005～1.0MOI剂量，以悬浮细胞接种法接种于人二倍体细胞(KMB17)，于32℃～37℃，PH7.2～8.0培养，培养2～20天后收获病毒即狂犬病毒固定毒CTN-DK1，并以相同方法继续传代。 

3、当传代至CTN-DK20时以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒继续传代9代，命名为CTN-DK29，再以CTN-DK29经终末稀释法筛选并传4代，命名为CTN-DK33，再以CTN-DK33经终末稀释法筛选并传至47代。 

4、CTN-1V₅株经过在人二倍体细胞(KMB17)中连续传代，逐渐适应于人二倍体细胞(KMB17)，其病毒滴度由第1代的4.5lgLD50/ml逐渐升高，到20代时病毒滴度≥6.9lgLD50/ml，经进一步筛选后，传代至47代，病毒滴度基本稳定在7.0lgLD50/ml以上。