[发明专利]含S盒的诱导型启动子及构建和在基因工程上的应用

说明书

技术领域   

本发明涉及一种诱导型启动子及构建和在基因工程上的应用，更具体地涉及了一种含S盒的诱导型启动子在水稻单子叶植物水稻抗病虫基因工程中的应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术   

真菌、细菌、病毒等病原微生物的侵染常造成各种农作物产量和质量的下降。培育和推广抗病品种是防治作物病害、保证作物稳产高产最安全有效的途径。利用植物自身抗病基因，通过常规育种和分子标记辅助育种方法已培育了许多抗病新品种。然而，抗性基因在种属间利用具有一定的局限性。转基因方法可克服上述局限，为作物抗病育种开辟了一条新途径，也是植物种质创新的重要途径之一。目前，在转基因技术中所使用的启动子大多数为组成型启动子，如果使用植物组织特异性启动子或病原诱导的植物启动子不仅会获得目的产物、达到预定目标，而且也不会产生副作用。

植物基因启动子是位于结构基因5’端上游区、含有顺式作用元件的DNA序列，决定着下游基因转录的特异性、方向和效率，是转录调控的中心。高等植物启动子区域存在各种特征元件，包括转录起始位点、TATA盒、起始因子和不同的顺式作用元件等。其中，TATA框是依赖于RNA聚合酶II转录所必需的，决定着转录起始，并调控着上游激活蛋白的行为；起始因子的功能与TATA盒相似，可影响转录的方向和起始点的定位，但一般不能改变启动子内包含2个核心序列因子的TATA活性。植物的许多性状与启动子的结构及其调控方式密切相关。因此，研究启动子不仅可以为基因工程提供重要的调控元件，也可促进从遗传分子基础上发掘具有重要利用价值的植物新资源。

根据植物启动子的转录模式可将其分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。

组成型启动子调控的基因表达不受时空限制和某种物质的诱导而在植物中表达出来。双子叶植物中常用的组成型启动子花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子是目前植物基因工程中使用最多的启动子，它驱使转基因产生组成型表达。它是异源病毒型启动子，在转基因植物中具有较高的表达活性。组成型启动子可应用于评价一个基因的生物学功能、转基因表达数量及其活性，但在改良转基因作物的实际应用中的主要问题是：(1)组成型启动子驱动的基因在植物各组织中均有不同程度表达，它驱动外源基因在植物的各种组织和所有发育阶段都会表达，产生大量异源蛋白或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡，增加了植株的代谢负担，有些产物甚至对植物的生长发育有毒，造成了物质和能量上的巨大浪费，同时还会改变植物的形态，影响植物正常的生长发育，甚至导致死亡；(2)植物所有细胞可能会全部进入防御模式，即使在无病原侵染时仍进行抗病反应；(3)组成型启动子调控表达的转基因产物可在人和动物食用的植物组织中积累，但是生物安全性要求不能有转基因产物。

如果用组织、器官特异型和病原诱导型启动子取代组成型启动子，使外源基因能够定时、定点、定量地在植物中表达，可以克服组成型启动子带来的问题。因此，组织特异型启动子和病原诱导型启动子的研究与应用是植物基因工程的重要内容和当今国内外研究的热点。利用启动子的最好方法可能是利用一个内源抗性基因启动子，这样既可以减少植物的代谢负担，又可以避免植物防御反应的假性激活。

比组成型表达和组织特异型表达更理想的表达模式是，只在需要的时间和地点表达而且仅在感染部位启动抗病相关基因表达。病原诱导型启动子能达到上述较为理想的结果，防止“逃离细胞死亡”现象出现，消除了对植物生长和发育影响的副作用。一种理想的病原诱导型启动子应迅速被广谱野生型病原侵染所激活，并有广谱抗病性。然而由于植物对不同病原菌采取了不同的防御机制，许多重要植物抗病分子机制尚不明确，所以，目前分离的大多数病原诱导型启动子很少能满足上述要求，仍然存在轻微的“逃离细胞死亡”的现象。因此，迫切需要分离或人工构建理想的病原诱导型启动子。植物抗病机制研究、转录组学和启动子克隆技术的发展，为人工构建新的病原诱导型启动子奠定了基础。

当前可使用的病原诱导型启动子缺乏的主要原因是分离各种天然的病原诱导型启动子较少。与天然病原诱导型启动子相比，人工构建病原诱导型启动子不仅更具有广谱性，而且可根据不同目的进行灵活选择，如消除启动子表达元件，可改变启动子的强度和病原诱导表达基因的数量和质量。研究发现，启动子元件在不同植物品种中防御信号是相对保守的。因此，通过收集各种植物启动子元件可以人工构建病原启动子。