[发明专利]一种仔猪副伤寒活疫苗的生产方法

说明书

技术背景

仔猪副伤寒(Paratyphus swine)又称猪沙门氏菌病(Swine salmonellosis)，主要是由猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)引起的一种仔猪高热传染病，目前主要通过接种疫苗进行预防。

仔猪副伤寒主要是由猪霍乱沙门氏菌引起幼猪和架子猪的败血症和肠炎，对成年猪多呈隐性带菌或为猪瘟的继发感染菌，间或引起人类的食物中毒以及侵害其他动物。

我国应用的仔猪副伤寒活疫苗CVCC500株(原C500株)(房晓文，李阳陇，黄昌炳，郑明，冯文达，孙伟等.仔猪副伤寒弱毒菌苗的研究，畜牧兽医学报，1979)，对仔猪有坚强免疫力，毒力稳定、安全，在猪沙门氏菌病防控中发挥了重要作用。但仍存在以下突出问题：1.疫苗采用普通肉汤作为培养基，该培养基主要成分牛肉浸液的质量受牛肉的种类、年龄、新鲜及消化程度影响大，造成批次间不稳定。2.疫苗采用1.5％明胶、5％蔗糖为保护剂，组方简单，冻干存活率低，保护功能较差(尤其在较高温度下)。目前国内14个生产仔猪副伤寒活疫苗的兽用生物制品企业，冻干存活率一般为50％～60％，需要-15℃以下保存。存活率低使疫苗中含有大量死亡菌体，死亡菌体崩解产生的内毒素，是产生过敏反应的因素之一，另外低温保存给边远地区储运和使用带来困难。据报道，每年0.07％～0.1％的猪接种后出现呕吐、痉挛、全身发疳、死亡等症状。

本发明的目的是研究一种合成培养基、耐热保护剂及其相配套的冻干曲线，制备一种冻干菌存率高，能在2～8℃长期保存的仔猪副伤寒活疫苗。

发明内容

本发明的技术方案是：将种子液按培养基总量的1％～2％接种于液体培养基中，37℃发酵或通气培养18～21h，培养过程中根据需要加入适量消泡剂，并根据pH升高情况加入适量灭菌40％葡萄糖以控制pH值。培养结束后立即加入经过灭菌并预热至37℃的冻干保护剂，充分混匀后按规定头份分装。分装过程中应注意保温振摇均匀，每头份活菌数不少于3×10⁹CFU。

1生产菌株

(1)菌株来源

猪霍乱沙门氏菌CVCC79500株(即原C500株)，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。其原始菌种系猪霍乱沙门氏菌CVCC79101株(来自苏联兽药监察所，编号为133/8。特性：该菌种肉肝胃培养物50×10⁴CFU活菌致死小鼠，5000×10⁴CFU活菌致死海猪，1.5×10⁸CFU活菌静脉注射致死仔猪。血清型：6，7:C:1，5。)经0.05％～1％醋酸铊的普通肉汤传500代，每间隔50代逐步提高醋酸铊浓度，人工致弱而来。

(2)菌株特性

1)毒力：用体重18～22g(30～35日龄)小白鼠皮下注射1×10⁸CFU活菌(0.2ml)，90％以上存活；豚鼠(350～400g)皮下注射15×10⁸CFU活菌，90％以上存活；家兔(体重1.5～2.0kg)皮下注射100×10⁸CFU活菌(1ml)，100％存活；仔猪(体重15kg以上)静脉注射30×10⁸CFU活菌(1ml)，100％存活。

2)菌株稳定性：在普通琼脂上连传20代，或在仔猪连通过3代，毒力不返强。

3)免疫原性：以25×10⁸CFU活菌免疫家兔(体重1.5kg)，一个月后攻击2～4MLD(最小致死剂量)强毒菌，保护80％以上；以25×10⁸CFU活菌免疫仔猪(体重12kg)，静脉注射致死剂量强毒，保护60％以上(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○版.化学工艺出版社，2000，以下称《规程》)。

2.疫苗制造及半成品检验

(1)生产用种子制备

将猪霍乱沙门氏菌(CVCC79500株)冻干菌种用普通肉汤稀释后，接种普通琼脂平板，37℃培养18～20h，选取中等大小的典型菌落(菌落为圆形、边缘整齐、突起、半透明、略湿润的光滑型)5～10个，混合接种于普通琼脂斜面3～5支，37℃培养24h，经纯粹检查合格后作为一级种子。在2～8℃保存，应不超过2个月。取一级种子按2％接种普通肉汤，37℃培养24h，纯粹检查合格后，作为种子液。

(2)培养基