[发明专利]一种快速检测山羊Lhx3基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种快速检测山羊Lhx3基因单核苷酸多态性(SNP)的PCR-RFLP(PCR-限制性片段长度多态性)方法。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组DNA中单个核苷酸变异引起的一种二等位基因，或二态的遗传变异，即在该位置上存在两种不同的碱基。其核苷酸的变异形式有转换、颠换、插入、缺失等，而且其中最少一种等位基因在群体中的频率不小于1％。研究表明，单碱基的突变，尤其是编码区的单碱基突变，会影响个体的表型，因此，基于SNP的分子标记技术可以用于家畜优良品种的选育。由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。

目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，其中DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阴性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。综上所述，以上现有方法不是一种检测具有限制性酶切位点SNP的理想的遗传标记方法。

然而，PCR-RFLP方法是一种检测影响限制性酶切位点的SNP的有效技术，在发现SNP位点后利用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

LIM同源框基因(LIM homeobox gene)，属于同源框基因(homeobox gene)家族。LIM同源框基因的蛋白质翻译产物不仅具有同源框结构域(homeodomain，HD)，而且含有2个富含半胱氨酸和组氨酸的LIM结构域(LIMdomain)。LIM同源框基因的蛋白质翻译产物LIM同源框转录因子(LIMhomeodomain transcription factor，LIM-HD)，作为一类家族性转录因子调控体内一些基因的表达，决定了组织和细胞的特异性分化。同源盒基因3(LIM-homeo box 3，Lhx3)，属于LIM同源框基因家族，在垂体以及神经系统发育过程中发挥重要作用，是一个非常重要的转录调控因子。由于Lhx3基因及其表达产物在垂体早期发育以及垂体激素分泌过程中发挥关键作用，尤其是对于催乳素以及生长激素的调控，揭示了该基因对于山羊的泌乳以及生长发育等方面可能发挥重要作用。已有研究报道，人Lhx3基因突变包括：Y116C，23bp缺失，第159位T碱基缺失，A210V，E173X，W224X，K50X和内含子3的突变，这些均引起了催乳素(PRL)和生长激素(GH)等分泌的不足(Davis et al.，2010；Bhangoo et al.，2006；Ellsworth et al.，2008)。在家畜中，仅见Jing等(2008)首次揭示中国黄牛Lhx3基因外显子2及其侧翼区存在3处SNP，其中有一处为同义突变。

目前，关于山羊Lhx3基因多态性及其检测方法的研究尚未见报道。因此，本发明利用PCR-RFLP对山羊Lhx3基因一个SNP，为分析该基因遗传变异与经济性状的关联奠定基础，有利于该基因作为山羊标记辅助选择(MAS)应用于山羊遗传育种实践。

参考文献