[发明专利]一种基于基因组RAPD分析的秦樱1号分子鉴定方法

权利要求书

1.一种基于基因组RAPD分析的秦樱1号分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取样及样品处理；

采用带木质芽接繁殖技术进行繁殖现有各种不同樱桃品种，随机选取生长状况一致的无性繁殖系个体5株，每株采集20片新梢顶部新鲜幼叶放入冰盒，迅速带回实验室置于-80℃超低温冰箱中储存备用；

2)DNA提取及其纯度和浓度检测；

樱桃总DNA的提取以生长期幼叶为材料，每个个体取鲜叶0.2g，采用改良2×CTAB法提取总DNA，并略加修改；使用0.6％琼脂糖对所获基因组DNA的纯度进行检测，利用蛋白核酸定量测定仪检测DNA浓度；然后将备用DNA溶于适量0.1×TE缓冲液中，在-20℃保存；

3)引物筛选和RAPD分析；

在对樱桃进行RAPD分析的PCR扩增体系优化后，选取3个在形态上差异比较大的樱桃品种进行RAPD引物筛选，从130个随机引物中筛选出46个扩增带清晰、多态性明显、重复性好的引物进行PCR扩增；在T Gradient PCR扩增仪上进行DNA扩增；扩增产物用1.6％、含0.5μg/ml EB的琼脂糖凝胶电泳分离2-3h，电压为6V/cm；在UV光下检测扩增结果并通过凝胶成像系统照相，分别得到随机扩增多态DNA标准图谱；

4)分析标准图谱得到秦樱1号两个特有RAPD引物，分别是OPH13和OPAO15引物；OPH13引物扩增出的特有DNA指纹的大小为908bp；OPAO15引物扩增出的特有DNA指纹的大小为966bp；

5)将待鉴定的樱桃新品种按照上述步骤进行分析，得到所需要鉴定樱桃新品种的随机扩增多态DNA图谱，将此随机扩增多态DNA图谱与标准图谱比较判定，可以判断是否为樱桃新品种秦樱1号。

2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：采用20μL反应体系进行PCR扩增，其中10×反应缓冲液为KCl 10mmol/L，(NH₄)₂SO₄8mmol/L，Tris-HCl 10mmol/L，PH 9.0，0.08％Nonidet P40，MgCl21.9mmol/L，dNTPs 0.2mmol/L，模板DNA 30ng，随机引物0.28μmol/L，Taq DNA聚合酶2U，最后在反应混合液上覆盖20μL矿物油。

3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，PCR反应程序为：96℃预变性5min 30s；接着94℃变性1min 30s，40℃复性1min，72℃延伸2min，40个循环；最后72℃后延伸10min。