[发明专利]特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种可以可在哺乳动物细胞内稳定表达的，能特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体及其该载体的表达方法。

背景技术

癌蛋白SET又称I2PP2A、TAF-Iβ，在细胞中广泛存在，是体内主要的丝-苏氨酸蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的胞内抑制蛋白，具有特异性、非竞争性和热稳定性，同时SET也是组蛋白分子伴侣。其在急性未分化型白血病中首次被鉴定，近年来的研究表明，SET是一个多功能蛋白，涉及细胞凋亡、肿瘤发生、转录调节、核小体装配、组蛋白结合等方面。Madeira A等报道在Alzheimer’s疾病中SET蛋白参与了神经元凋亡过程，为此疾病机理提供了新的线索；PP2A活性的缺失或改变与肿瘤发生有一定联系，许多细胞毒素的促肿瘤作用与抑制PP2A的活性有关，PP2A被认为可能是一个潜在的肿瘤抑制因子。而SET蛋白作为PP2A的胞内抑制蛋白，其与肿瘤发生也密切相关，如Wilm’s肿瘤中SET mRNA和蛋白表达都显著上升，通过癌蛋白SET的磷酸化可促进前列腺癌细胞生长，肝细胞癌变中观察到I2PP2A/SET基因表达上调，PP2A活性受抑制；SET蛋白能诱导原癌基因C-Jun的表达和影响转录因子AP-1的活性，同时也能增强激活蛋白-1(activator protein-1)的转录活性；SET作为组蛋白分子伴侣，能抑制组蛋白和核小体的乙酰化，从而导致组蛋白依赖性转录的沉默和DNA去甲基化激活受阻。

三氯乙烯(Trichloroethylene，TCE)为不饱和卤代脂肪羟类化学物，是电子、制革和五金行业常用的有机清洗溶剂，经吸入和皮肤接触后可引起肝脏、肾脏、心脏及皮肤的损害。近年来，三氯乙烯中毒事件呈上升趋势，死亡事件也时有报道。三氯乙烯中毒主要表现为药疹样皮炎，但肝脏功能损害情况亦相当严重。刘建军等利用蛋白质组学技术研究三氯乙烯刺激肝细胞后蛋白质差异表达，结果发现其中的SET差异蛋白在TCE低剂量时表达上调，并且随着TCE剂量的增加，其表达继续上升。

自1998年Fire等人发现RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象以来，RNAi技术已被证实是一种特异、高效、经济的抑制基因表达的手段而受到极大的重视和欢迎。2001年，RNAi技术被成功应用于哺乳动物细胞，其应用前景更加诱人，已经成为疾病研究和治疗的热点。研究者们可以利用这项技术对目标基因或蛋白质进行特异性表达沉默，通过观察其表达被抑制的细胞或者生物体的从形态到各项生理生化指标的变化，对该基因或蛋白质的功能及参与的信号网络进行研究。这比传统的基因敲除方法要简单而且方便得多，因此短短几年，就有了很多突破性的成果，其中研究得最多的是与疾病相关的一些基因和蛋白。

RNA干扰是与靶基因序列同源的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)所诱导的一种特异性的转录后基因沉默现象(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。外源性或内源性的双链RNA进入细胞后，在三磷酸腺苷(ATP)依赖性RNA酶III(Dicer，DCR)的作用下被切割成3’端有2个突出碱基的21-23nt长度的小分子干扰RNA(small interference RNA，siRNA)；这些siRNA与RNAi特异性酶结合，形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)；而后RISC在siRNA反义链的指导下与siRNA同源靶mRNA相结合，RISC中的重要组成成分Ago-2蛋白在近中点位置将其切割A，随后靶mRNA被细胞内RNA酶降解，转录后的mRNA就不能翻译出相对应的蛋白，而RISC游离出来，寻找新的目标分子，从而达到抑制靶基因表达的作用。

现有技术中，没有发现存在可长效稳定表达，特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体，而且现有的其它shRNA表达载体往往存在转染效率低，干扰效果不稳定，载体用量大，而且通常都需要多次瞬时转染等缺陷。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种可以长效稳定表达，且能特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体，避免多次瞬时转染造成繁琐流程，能有效地抑制SET蛋白表达，可以用于制备治疗SET蛋白表达异常相关疾病的药物中，解决现有技术存在的缺陷。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：