[发明专利]羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种羊草的盐碱胁迫诱导蛋白基因。 

背景技术

将植物转基因技术应用于强耐盐碱植物的培育是一种有效的途径，已经有各种基因获得专利的报道。目前，应用于农作物分子育种的抗盐碱基因多来源于非盐生的模式植物拟南芥、水稻等植物中，虽然通过转基因过量表达有提高作物抗逆性的报道，但是其转基因效率及功能尚有待提高。 

我国大部分地区盐碱化土壤多为氯化盐(Cl^-)盐碱土，这种土壤主要表现为盐化影响，即Na⁺对植物的胁迫，而东北地区盐碱地的突出特点是不仅存在氯化盐(Cl^-)盐碱土，还有大面积的碳酸盐(CO₃^2-)盐碱土，即不仅存在高盐离子而且同时伴有高pH危害。目前，对植物耐盐碱的研究还大多集中于植物耐NaCl盐性，而对植物耐碱性特别是耐碳酸盐(高pH)研究还亟待深入。 

羊草(Leymus chinensis)属禾本科赖草属植物，是一种广布于东北地区的优良牧草，尤其突出的是羊草具有较强的耐盐碱性，长期的盐碱地条件下生长的羊草具有了一系列适应盐碱环境的优良特性，其中蕴藏着大量的抗逆基因，是进行抗性基因筛选的良好材料。 

发明内容

本发明目的是为了解决现有耐盐基因转化获得的耐盐转基因植物的耐盐能力不高的问题，克隆一种抗盐碱能力强的牧草羊草的一种盐碱胁迫应答基因一羊草(Leymus chinensis)碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因。这种抗逆相关基因可以用于科研与生产中，用于其详细的抗性机理等方面的研究，并通过转基因技术来培育抗逆植物新品种。羊草是一种广泛分布于东北地区的优良牧草，被称为 “牧草中的细粮”。另外，羊草还具有突出的耐盐碱性，可在黑龙江的盐碱土壤地区种植，长期的盐碱地条件下生长的羊草具有了一系列适应盐碱环境的优良特性，其中蕴藏着大量的抗逆基因。长期以来，对羊草的研究主要集中在生态学、生殖生物学方面，而针对羊草的抗盐碱特性的研究也主要集中在生理学指标的测定上，但从分子生物学角度对羊草抗盐碱特性进行研究还比较少，远不能满足对其相关特性分子水平研究的要求。本发明通过克隆出抗盐碱能力很强的羊草的一种盐碱胁迫应答基因-盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因，然后通过Northern杂交和遗传转化技术检测其在盐碱胁迫下的表达情况，分析它是否与植物的抗盐碱能力相关。本发明的基因编码区长786bp，编码262个氨基酸。经序列同源性blast分析表明，与禾本科植物大麦、小麦等相比同源性较高，DNA序列有约10％的差异，氨基酸序列差异小于5％，本发明获得的羊草14-3-3蛋白基因未见基因登录信息。应用Northern杂交研究盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因在盐碱胁迫后的表达，结果发现该基因的表达受盐碱胁迫诱导。将克隆的14-3-3蛋白基因构建植物表达载体pCAMBIA-1301-14-3-3，转化露地菊中，发现转基因菊花与对照相比具有明显的抗盐碱能力，转基因露地菊可以在NaCl中能够正常生根、生长，而非转基因露地菊则出现生根抑制、生长缓慢现象，说明转基因露地菊具有明显的抗盐碱能力。 

附图说明

图1为14-3-3蛋白基因PCR扩增电泳图，1：DNA Marker DL2000；2：目的片段；图2为盐胁迫后羊草中14-3-3基因的表达，样品顺序由1至7分别为200mmol/L Na₂CO₃浇灌处理0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h；图3为露地菊“火焰”转14-3-3基因及未转基因苗盐处理生根效果CK：“火焰”为转化植株；2#：转基因株系2；5#：转基因株系5；A：NaCl浓度0；B：NaCl浓度 100mmol/L；C：NaCl浓度200mmol/L。 

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。 

具体实施方式一：本实施方式羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因的编码区序列如说明书附图中所示。 

具体实施方式二：本实施方式羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因的氨基酸序列如说明书附图中所示。 

具体实施方式三：本实施方式羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因按以下步骤制备： 

(一)羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因的克隆