[发明专利]一种筛选抗体的方法

权利要求书

1.一种筛选与目标蛋白结合的目的蛋白的方法，包括如下步骤：

1)将目标蛋白展示于离体真核细胞的细胞膜表面，得到表面展示有目标蛋白的真核细胞；

2)将待筛选蛋白库中的各蛋白分别展示于细菌原生质体表面，得到表面展示有待筛选蛋白的细菌原生质体库；

3)将步骤1)得到的真核细胞与步骤2)得到的细菌原生质体库共同孵育，使展示于所述真核细胞表面的目标蛋白和展示于所述细菌原生质体表面的蛋白之间发生特异性的相互配对，得到所述真核细胞与所述细菌原生质体的特异性结合物，将所述结合物从孵育体系中分离出来；

4)从步骤3)得到的结合物中分离得到与展示于真核细胞表面的目标蛋白特异性结合的目的蛋白或目的蛋白的编码基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述孵育的条件包括：所述孵育体系的pH值为5.0-7.5。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述孵育的条件包括：所述孵育体系的pH值为5.0，5.3，5.5，5.8，6.0，6.3，6.5，6.8，7.0，7.3或7.5。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述孵育的条件是：温度为30-37℃和时间为0.5-2小时；所述温度具体为30℃或37℃，所述时间具体为0.5小时或1小时或2小时。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于，步骤3)中，将所述结合物从孵育体系中分离出来的步骤是，首先使用平板淘选法筛选，然后使用流式分选法分选。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，使用流式分选法的步骤为：首先从所述孵育体系中去除未同所述真核细胞形成特异性结合物的细菌原生质体，再通过流式细胞仪筛选，收集所述真核细胞与原生质体发生特异性结合的结合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：从所述孵育体系中去除未同所述真核细胞形成特异性结合物的细菌原生质体的步骤为：将所述的孵育体系常温300g离心1.5-3分钟后，收集沉淀，弃去上清。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于，

步骤1)中，所述将目标蛋白展示于真核细胞的细胞膜表面是由包括如下步骤的方法制备得到的：将含有所述目标蛋白编码基因的重组表达载体转入所述真核细胞中，得到重组真核细胞，培养该重组真核细胞并诱导所述重组载体的表达，得到所述表面展示有目标蛋白的真核细胞；

步骤2)中，将待筛选蛋白库中的各蛋白分别展示于细菌原生质体表面的方法包括如下步骤：将待筛选蛋白的编码基因插入细菌表达载体中，得到表达所述待筛选蛋白的重组载体，将所述表达待筛选蛋白的重组载体转入宿主细菌，得到重组细菌，培养所述重组细菌并诱导所述重组载体的表达，再提取重组细菌的原生质体，得到所述表面展示有待筛选蛋白的细菌原生质体。

9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于，所述含有所述目标蛋白的编码基因的重组载体是受四环素调控的重组载体；所述培养该重组真核细胞并诱导所述重组载体的表达的方法为：将插入外源基因后的真核表达载体转入所述真核细胞，并用四环素诱导所述真核细胞表达目标蛋白。

10.根据权利要求1-9所述的方法，其特征在于，所述宿主细菌中还转入用于通过荧光信号筛选原生质体的荧光蛋白表达载体。所述荧光蛋白表达载体可以是在细菌中表达任何颜色荧光蛋白质的载体，优选为pBAD30-KmR-GFPmut2。

11.根据权利要求1-10中任一所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白的编码基因是人源化的；所述真核细胞是人非小细胞肺癌细胞株H1299；所述真核表达载体为真核细胞膜表面展示载体；所述真核细胞膜表面展示载体是核苷酸序列是SEQ ID：6所示的载体pUHD10-3-display。

12.根据权利要求1-11中任一所述的方法，其特征在于，所述宿主细菌为大肠杆菌，优选为E.coli Jude-1。

13.根据权利要求1-12中任一所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，所述从结合物中分离得到目的蛋白或目的蛋白的编码基因的方法包括如下步骤：从所述结合物中提取所述表达目的蛋白的重组载体，对重组载体进行测序，得到所述目的蛋白的编码基因。