[发明专利]一种检测光滑念珠菌的DNA探针、基因芯片及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测光滑念珠菌的DNA探针、基因芯片及其应用。

背景技术

侵袭性真菌感染是真菌入侵人体而导致血液感染、各个脏器感染或全身播散的严重感染。近20年来侵袭性真菌感染的发病呈明显增长趋势，这与大量应用广谱抗生素、抗癌放疗、化疗以及其他免疫抑制剂、类固醇药物、器官移植、静脉插管和各种侵袭性操作有关。

侵袭性真菌感染主要的致病真菌有念珠菌属、曲霉属、隐球菌属等条件致病真菌，还有组织胞浆菌、皮炎芽生菌、孢子丝菌等地方流行性致病真菌。不同环境下，感染的真菌种类不同。侵袭性真菌感染早期没有特异性表现，所以很容易被掩盖，病死率很高。

目前临床常用的检测真菌的技术主要有：

(一)镜检及培养、鉴定：如六胺银染色、PAS染色、银氨G-S染色法、10％KOH法以及真菌培养法是临床最常用的鉴定手段，但直接镜检特异性差、敏感性不足，不能鉴定出真菌种类。真菌培养虽能鉴定真菌种类，但培养条件苛刻，培养时间长，假阴性高，敏感性不足，无法辅助临床治疗。

(二)免疫学方法：免疫学方法的基本原理是利用抗原与抗体的特异结合，来达到相互间的特异探察。该法主要用于检测真菌的抗原、抗体、代谢产物及细胞成分。能根据真菌抗原性的不同将真菌分类。但抗体的特异性限制了该项技术的发展。

免疫组化、酶联免疫吸附试验、免疫印迹法及凝集反应都是基于免疫学方法检测真菌的手段，但目前广泛应用于临床的仅有G试验，G试验检测的是真菌的细胞壁成分：(1，3)-β-D-葡聚糖，人体的吞噬细胞吞噬真菌后，能持续释放该物质，使血液及体液中含量增高(浅部真菌感染无类似现象)。适用于除隐球菌和接合菌外的所有深部真菌感染的早期诊断，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能确定菌种。临床应用中发现有诸多假阳性可能，例如：

(1)使用纤维素膜进行血透标本或患者暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料；

(2)静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品；

(3)链球菌血症；

(4)操作者处理标本时存在污染。

另外，使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也可能造成假阳性。

(三)分子生物学技术：

包括原位杂交、聚合酶链反应、DNA中G+C mol％含量测定、随机扩增多态性DNA(RAPD)分析、限制性内切酶多态性分析(RFLP)等，但上述技术均耗时耗力，不具有高通量的特点，不能用少量的样本快速同时检测多种可能存在的真菌，因此多局限于实验室研究，尚不能真正应用于临床。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测光滑念珠菌的DNA探针，具有SEQID No.1所示序列，其与光滑念珠菌DNA特异性结合，检测光滑念珠菌灵敏度高。

本发明所述DNA探针可广泛应用于生物学、医学领域，如与以PCR技术为基础的核酸杂交技术结合，进行生物学分析或临床诊断。

本发明结合基因芯片技术，可实现小样本、高通量、特异、快速、自动化检测光滑念珠菌的目的。本发明提供的一种用于真菌检测的基因芯片，通过将特异性寡核苷酸探针固定在固相载体表面形成，所述寡核苷酸探针包含具有SEQ ID No.1所示序列的DNA探针。探针、引物与真菌目的基因之间的关系如表1所示。

表1.本发明所述基因芯片所使用的引物及探针

作为优选，所述固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片、微粒和塑料片。

本发明的基因芯片所采用的固相载体选自任何可用于制备基因芯片的材料，包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚丙乙烯、玻璃片、硅片、微粒和塑料片。所述的固相载体经不同的化学修饰后，在其表面带有可以固定核酸分子的活性基团，这些基团包括但不限于氨基(-NH₂)、醛基(-CHO)、羧基(-COOH)和巯基(-SH)。

本发明所述基因芯片在所述固相载体上连接针对光滑念珠菌的特异性核酸探针，所述探针可以为单链或双链DNA分子，其在适当的条件下可以与光滑念珠菌基因特异性杂交。所述探针可以通过DNA自动合成或PCR扩增而获得。所述探针在其与载体连接的一端可以选择性地添加一个目的在于增加探针的空间活动性以利于杂交的连接臂。