[发明专利]家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法

说明书

 

技术领域

本发明涉及由家蚕核型多角体病毒BmNPV引起的家蚕血液型脓病的早期分子生物学诊断技术，属家蚕蚕病防治生物技术领域。

背景技术

家蚕是有重要经济价值的鳞翅目昆虫，在国际市场上，我国生丝出口占世界生丝出口总量的90%以上，绸缎出口占50%以上，丝绸服装出口也占相当大的比重。

家蚕核型多角体病毒（BmNPV）是一种环状双链DNA，由其引起的家蚕核型多角体病是茧丝生产中最重要的病害，该病传染性极强，难以控制。每年全国蚕桑生产因蚕病的损失占到总产量的30%，其中70%由核型多角体病毒（BmNPV）引起。该病在各龄幼虫、蛹、成虫期均可发生，每年都有5-20%的发病率，严重时可达到50%。目前我国还没有对BmNPV引起的疾病进行早期规范化的诊断技术，生产上主要依靠病症来进行诊断，即在发病中后期才可以诊断，而此时病蚕已不可用药物治疗，严重影响了蚕农的生产积极性和蚕桑产业的发展。

基于PCR的诊断技术已经在疾病的诊断中发挥了重要的作用，它具有快速、灵敏、准确的特点，并已在人类的一些由病原微生物引起的疾病如HIV、SARS等中得到广泛应用。染病家蚕血细胞中BmNPV多角体（occlusionbodies,OBs）最早是在1856年由Maestri和Cornalia分别利用光学显微镜观察观察到的，这也是目前大多数检测NPV的方法，其最低检测水平为10⁶个多角体。杂交能检测到20～5000PIBs（0.1ngDNA），但该方法技术操作十分复杂，严重限制了其在疾病诊断中的应用。本发明方法提取病蚕血液的基因组DNA，利用PCR的方法则可检测到1～5fg的病毒DNA，（1fg=10^-6ng=10^-15g），灵敏度远高于前两种方法，在幼虫感染两天就可检测到。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速、灵敏和特异性强的早期防治家蚕重大病害BmNPV病原检测方法。

本发明的实现过程如下：

一种家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法，检测步骤如下：

（1）对染病家蚕的血液通过乙醇沉淀法进行处理，去除PCR反应抑制物，

酒精擦拭染病家蚕体表，以防污染影响实验结果，取10ul家蚕血液到1.5mL离心管中，加入0.5mL75%乙醇，涡旋1min后，10000rpm离心1分钟，倒去上清，空气中干燥5min，以去除乙醇残留，加入50ulTE，充分溶解；

（2）根据家蚕血液型脓病病源BmNPV的基因组分析，设计多角体蛋白基因(polyhedron,polh)PCR引物，

引物序列为：polhf：ATGCCGAATTATTCATACACCCC

                Polhr：TAATACGCCGGACCAGTGAACAG

（3）对多角体蛋白基因进行PCR扩增，反应体系中加入了抗PCR反应抑制物BSA，同时以家蚕线粒体COI基因的引物进行PCR反应做阳性对照；

（4）分别取正常家蚕血液和感染了白僵病、绿僵病、细菌病、微孢子病的家蚕的染病中肠，进行PCR反应的特异性分析；

（5）琼脂糖胶电泳检测上述PCR反应结果。

本发明的优点与积极效果：本发明检测方法简易的、易于规模化、低成本，直接利用家蚕组织进行PCR检查BmNPV技术，与现有技术相比具有如下优点：

（1）由于血液中含有大量的PCR反应抑制物，不能直接进行检测，因此传统的基于PCR的检测需要从血液中纯化病菌的DNA。该方法操作繁琐，不利于规模化应用，现有的技术也未曾提供不通过纯化家蚕的血液DNA进行BmNPV检测的方法。本发明省却了染病家蚕组织的DNA提取过程，能够缩短诊断过程，降低诊断成本，加快PCR技术在蚕病诊断上的应用。

（2）以往基于PCR检测BmNPV的方法，设计的PCR扩增引物多为BmNPV功能基因上的一段核酸序列，未考虑其与家蚕基因组序列的相似性。而本发明的引物序列充分考虑了BmNPV基因组序列和家蚕基因组序列的相似性，选取BmNPV基因组的特异序列，即杆状病毒的多角体蛋白基因的编码序列作为扩增的目的条带，减少了疾病检测中的假阳性，同时本发明运用鳞翅目昆虫线粒体COI基因通用的扩增引物作为对照，能够避免疾病检测中的假阴性。