[发明专利]一种表达弹性蛋白酶2B的基因工程菌、其构建方法及应用

权利要求书

1.含有ELA2B基因的表达载体，所述ELA2B基因具有Seq ID No：1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，出发载体为pET30a。

3.含有权利要求2所述表达载体的工程菌，其特征在于，其为大肠杆菌工程菌。

4.如权利要求3所述的工程菌，其特征在于，出发菌株为大肠杆菌BL21。

5.构建权利要求3或4所述工程菌的方法，其特征在于，其包括步骤：

1)从人体肾脏组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到ELA2B基因；

2)将步骤1)中得到的ELA2B基因插入到表达载体中；

3)将步骤2)中构建的表达载体转入大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌工程菌。

6.权利要求5所述工程菌的诱导培养方法，其包括：待工程菌于37℃培养至对数生长期后，按3～5v/v％的接种量将菌液接种于LB液体培养基中，当OD₆₀₀达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为1mM，在温度37℃，200rpm的条件下诱导培养4h。

7.权利要求4所述工程菌表达的ELA2B蛋白的纯化方法，包括如下步骤：

1)离心并收集工程菌，破碎菌体，提取并溶解含有ELA2B蛋白的包涵体；

2)用His TrapTM FF凝胶柱进行亲和层析；

3)通过梯度透析，复性ELA2B蛋白。

8.如权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)离心并收集工程菌，向菌体中加入裂解液及溶菌酶，超声破碎，提取并溶解含有ELA2B蛋白的包涵体；用洗涤液超声洗涤2次，然后用尿素洗涤液超声洗涤1次，得到包涵体蛋白；

所述裂解液含有50mmol/L Tris-Cl、10mmol/L EDTA、100mmol/LNaCl、pH值为8.0；所述洗涤液含有50mmol/L Tris-Cl、10mmol/LEDTA、100mmol/L NaCl、0.5v/v％Triton及10mmol/L β-巯基乙醇，pH值为8.0；所述尿素洗涤液含有100mmol/L Tris-Cl及1mol/L尿素，pH值为8.0；

2)将步骤1)中得到的包涵体蛋白溶于结合缓冲液中，与HisTrapTM FF凝胶柱结合，用洗涤缓冲液除去未结合的蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱，得到目的蛋白；

所述结合缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、40mmol/L咪唑、0.5mol/LNaCl、8mol/L尿素，pH值为8.0；所述洗涤缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、100mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、8mol/L尿素，pH值为8.0；所述洗脱缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、500mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、8mol/L尿素，pH值为8.0；

3)用尿素缓冲液对步骤2)中得到的目的蛋白进行梯度透析，每种浓度的尿素缓冲液均在8h内透析3次，复性ELA2B蛋白；

所述尿素缓冲液分别为8、6、4、2、1、0.5、0mol/L的尿素与50mmol/L Tris-Cl配制的pH值为8.0的溶液。