[发明专利]大豆茎溃疡病菌检测用阳性标准分子、制备及检测方法

权利要求书

1.一种大豆茎溃疡病菌检测用阳性标准分子，其特征在于：所述阳性标准分子为能够自主复制的质粒分子，且所述质粒中含有大豆茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的大豆茎溃疡病菌检测用阳性标准分子，其特征在于：所述大豆茎溃疡病菌包括大豆北方茎溃疡病菌(DPC)和大豆南方茎溃疡病菌(DPM)中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的大豆茎溃疡病菌检测用阳性标准分子，其特征在于：所述质粒中含有大豆北方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区的DNA序列和大豆南方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区的DNA序列中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的大豆茎溃疡病菌检测用阳性标准分子，其特征在于：所述大豆北方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区的DNA序列含有SeqID No.1所示的序列，所述大豆南方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区的DNA序列含有Seq ID No.2所示的序列。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的大豆茎溃疡病菌检测用阳性标准分子，其特征在于：所述质粒为T载体。

6.根据权利要求5所述的大豆茎溃疡病菌检测用阳性标准分子，其特征在于：所述质粒为pMD18-T。

7.权利要求1～6任意一项所述的大豆茎溃疡病菌检测用阳性标准分子的制备方法，所述方法包括：

设计PCR引物，并以大豆茎溃疡病菌基因组DNA为模板扩增得到大豆茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区的DNA序列，并转化质粒。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述质粒中同时含有大豆北方茎溃疡病菌和大豆南方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区DNA序列，并且所述方法包括将大豆北方茎溃疡病菌和大豆南方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区的DNA序列分别转化质粒，再将得到的重组子经酶切及拼接得到所述阳性标准分子。

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于：所述PCR引物包括用于扩增大豆北方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区DNA序列的引物对1和用于扩增大豆南方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区DNA序列的引物对2中的至少一种，

引物对1含有下述Seq ID No.3和Seq ID No.4所示的序列，

Seq ID No.3：5′-TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

Seq ID No.4：5′-GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′

引物对2含有下述Seq ID No.5和Seq ID No.6所示的序列，

Seq ID No.5：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

Seq ID No.6：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。

10.权利要求1～6任意一项所述的大豆茎溃疡病菌检测用阳性标准分子的检测方法，所述方法包括，利用特异性检测引物和探针，以所述阳性标准分子为模板进行实时荧光PCR反应，所述特异性检测引物和探针包括以下两组中的至少一组，并且所述探针5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，

a、针对大豆北方茎溃疡病菌的特异性检测引物DPC-F、DPC-R和探针DPC-P：

DPC-F：5′-GCTTGGTGTTGGGGCACT-3′ Seq ID No.7

DPC-R：5′-TACGCTCGGGGTCCTGG-3′  Seq ID No.8

DPC-P：5′-TGAAATTCATTGGCGAGCT-3′Seq ID No.9

b、针对大豆南方茎溃疡病菌的特异性检测引物DPM-F、DPM-R和探针DPM-P：

DPM-F：5′-CCAGAAACCCTTTGTGAACTC-3′Seq ID No.10

DPM-R：5′-TGTTTTTTGCTCAGAGTTTCG-3′Seq ID No.11

DPM-P：5′-ACAAGAGTTGGCTTGGC-3′    Seq ID No.12。