[发明专利]一种采用超顺磁性纳米颗粒分离组氨酸标签蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及纳米材料领域，具体说是一种采用超顺磁性纳米颗粒分离组氨酸标签蛋白质的方法。

背景技术

生物工程，是20世纪70年代初开始兴起的一门新兴的综合性应用学科，90年代诞生了基于系统论的生物工程，从生物技术的角度定义生物工程就是应用生命科学及工程学的原理，借助生物体作为反应器或用生物的成分作工具以提供产品来为社会服务的生物技术，包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程等。信息技术的发展改变了人类的生活方式，而生物工程的突破将帮助人类延年益寿。例如，许多活性蛋白的生产是从生物组织中提取的，受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。而微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应蛋白成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的蛋白，不但能解决产量问题，还能降低生产成本。在生物合成过程中，为目的蛋白引入合适的亲和层析纯化标签，不仅不会影响蛋白的生物活性，而且可以大大简化纯化步骤。作为目前最常用的一种蛋白标签，组氨酸标签具有多种优点：只有6个组氨酸，分子量很小，一般不需要用酶切去除；可以在变性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能够保持结合力；无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析；可以方便的用固定金属离子亲和色谱(Immobilized Metal-ionaffinity chromatography，IMAC)纯化。

IMAC是Porath et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白。1987年Smith et al.发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni²⁺-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni²⁺-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。

目前的IMAC柱层析技术虽然有这么多的优点，但是它仍然具有传统色谱层析技术共有的缺点，即不能直接处理发酵液或细胞破碎匀浆液，因为原料液中的固体颗粒会堵塞层析柱，必须预先采用高速离心或微滤方法除去细胞或细胞碎片。这种分离模式分离时间长，成本高，而且在固体颗粒的分离中往往会有一定的活性损失。另外，传统层析是将事先制备好的颗粒状介质填充在层析柱中进行分离纯化的。由于颗粒粒的不均匀性和颗粒内外的扩散阻力，导致洗脱峰峰展宽，分离效率下降。层析分离效率或理论塔板高度与流动相流速关系很大，存在一个流速极值点(这个流速实际很低)、高于这个流速时，理论塔板高度增大，分离效率下降。而且由于颗粒内扩散导致蛋白质实际动态吸附容量很低。近年来，生物技术的迅速发展对目标产品的分离纯化技术提出了更新和更高的要求。除了层析床柱的设计之外，新型吸附介质的开发和制备也成为蛋白质分离中一个关键的研究领域。传统的多孔吸附介质面对蛋白质等大分子的分离表现出了诸多的不足。例如，分离过程生物大分子特别是细胞碎片对吸附载体的相互作用很容易引起分离时间的延长甚至是柱堵塞；吸附载体孔径的增大缩短分离时间的同时又会导致分离效率的降低；减小吸附介质尺寸增大了分离效率但是又带来了吸附介质难分离的问题。在由此可见，如何制备选择性高、扩散阻力小、表面积大而且又方便回收再生的吸附介质成为目前蛋白质分离中需要研究的问题。