[发明专利]一种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法

权利要求书

1.一种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法，包括如下顺序步骤：1)选取甜高粱旗叶期长约2-5cm幼穗，切成薄片，将其接种于诱导培养基中培养，所述诱导培养基为：MS基础培养基+2，4-D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+PVP 10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7.2g/L琼脂，pH 5.8；形成愈伤组织；2)选取生长状态良好的幼穗或幼穗愈伤组织块接种于高渗培养基中培养，所述高渗培养基为：MS基础培养基+2，4-D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7.2g/L琼脂+0.4M甘露醇，pH 5.8；3)直接转化法转入外源基因，继续在高渗培养基中培养过夜；4)转入继代培养基中恢复培养，所述继代培养基为：MS基础培养基+2，4-D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7.2g/L琼脂，pH 5.8；5)再转入筛选培养基上筛选，所述筛选培养基为：MS继代培养基+加适宜的筛选剂，pH 5.8；6)将获得的抗性愈伤转接于分化培养基中培养至出苗，所述分化培养基为：MS基础培养基+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 8-10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH 5.8；7)将苗移入生根培养基中培养出根，所述生根培养基为：1/2MS基础培养基+肌醇500mg/L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP 8-10mg/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH 5.8；8)移栽至温室花盆或大田。

2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，所述幼穗长度为2-3cm，薄片约3mm长。所述步骤2)中的培养，每皿30-40块愈伤组织。

3.根据权利要求1所述的遗传转化方法，所述直接转化法为基因枪法。

4.根据权利要求3所述的遗传转化方法，所述基因枪法是采用包裹含外源基因的质粒DNA的金粉轰击待转化受体。

5.根据权利要求4所述的遗传转化方法，所述包裹方法为：取25μl直径1μm的金粉悬浮液浓度为50mg/ml放入1.5mL eppendorf管中，加入2.5μl含外源基因的质粒DNA溶液浓度为1μg/μl，混匀后再分别加入25μl 2.5mol/L CaCl₂溶液和10μl 0.1mol/L亚精胺溶液，冰上静置10min，离心3sec转速为1000rpm，弃去上清液，加入50μl无水乙醇，充分悬浮后即可。

6.根据权利要求5所述的遗传转化方法，所述外源基因为Bt杀虫基因cry1Ah，所述筛选剂为0.8mM草甘膦异丙胺盐。

7.根据权利要求1所述的遗传转化方法，所述恢复培养时间为一周，所述筛选时间为二周。

8.根据权利要求1所述的遗传转化方法，所述分化培养基中的培养条件为：在光周期16小时光照与8小时黑暗循环于28℃条件下培养，每两周继代一次，所述步骤7)转入之前，甜高粱植株约为2-3cm高。

9.根据权利要求1所述的遗传转化方法，所述步骤8)转入之前，甜高粱植株处于3-4叶期。

10.根据权利要求1所述的遗传转化方法，所述甜高粱品种为“BABUSH”和“MN-3025”。