[发明专利]一种酸性橙Ⅱ的酶联免疫检测试剂盒

说明书

【技术领域】

本发明属于酶联免疫吸附分析技术领域，涉及一种酶联免疫检测试剂盒，尤其涉及一种酸性橙Ⅱ的酶联免疫检测试剂盒。

【背景技术】

偶氮类染料(azo dye)是一种重要的合成染料，是纺织品服装在印染工艺中应用最广泛的一类合成染料，用于多种天然和合成纤维的染色和印花，也用于油漆、塑料、橡胶等的着色。偶氮染料本身无任何直接的致癌作用，但是在体内还原分解，可形成芳香胺化合物，芳香胺在体内经过代谢活动后与靶细胞作用可能使DNA发生变化，成为人体病变的诱发因素，对人体或动物有潜在的致癌性和致突变性。由于其致癌性和致突变性，世界上很多国家都对偶氮类染料的使用实施了严格的规定。日本曾批准使用的合成色素有27种，现已禁止使用其中的16种。美国1960年允许使用的合成色素有35种，现仅剩下7种。瑞典、芬兰、挪威、印度、丹麦、法国等早已禁止使用偶氮类色素，其中挪威等一些国家还完全禁止使用任何化学合成色素。此外还有一些国家已禁止在肉类、鱼类及其加工品、水果及其制品、调味品、婴儿食品、糕点等食品中添加合成色素。我国对在食品中添加合成色素也有严格的限制：凡是肉类及其加工品、鱼类及其加工品、醋、酱油、腐乳等调味品、水果及其制品、乳类及乳制品、婴儿食品、饼干、糕点都不能使用人工合成色素。只有汽水、冷饮食品、糖果、配制酒和果汁露可以少量使用，一般不得超过1/10000。目前我国批准使用的食用合成色素有9个品种，即苋菜红、诱惑红、胭脂红、新红、酸性红、柠檬黄、日落黄、靛蓝和亮蓝。酸性橙Ⅱ是一类合成型偶氮染料，广泛用于纺织印染、皮革、造纸、橡胶、塑料、涂料、化妆品、木材加工等，在我国禁止被用作食品添加剂。但是由于酸性橙Ⅱ色泽鲜艳、着色稳定、价格低廉等特点，一些不法商贩为了牟取暴利将其作为食用色素用于食品生产与加工。我国市售和出口海外的蜜饯、豆制品、卤制品、辣椒面、红壳瓜子等均被检出过含有酸性橙Ⅱ等类似合成非食用色素，严重危害了消费者的身体健康，并且常常导致出口食品被迫就地销毁。所以，酸性橙Ⅱ检测方法的开发研究已刻不容缓。

在偶氮类色素的检测中，仪器法如高效液相色谱以及液相-质谱联用是应用最广泛的方法。这些方法准确，稳定，可靠，可以作为标准方法。但仪器法价格昂贵，费时较长，需要大型仪器设备，需要专门的技术人员，所以难以用于现场操作。

酶联免疫检测法(ELISA)提供了一种极好的扫描手段。该法具有快速，准确，简易，不需要专门人员操作等优点，这使得ELISA法成为一种理想的，可用于常规扫描的检测方法，因此建立一种有效的ELISA法检测酸性橙Ⅱ的方法具有重要意义。

【发明内容】

本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种酸性橙Ⅱ的酶联免疫检测试剂盒。

本发明提供的酸性橙Ⅱ酶联免疫检测试剂盒中试剂的组成包括：

A、各孔包被有包被抗原即酸性橙Ⅱ与载体蛋白的偶联物的酶标板1块；

B、酸性橙Ⅱ标准溶液：0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL各1瓶；

C、酶标羊抗兔抗体溶液：辣根过氧化酶-羊抗兔IgG原液，使用时用洗涤溶液稀释成1∶2000的工作浓度；

D、酸性橙Ⅱ抗体溶液：人工免疫抗原免疫动物制备所得的多克隆抗体原液，使用时用洗涤溶液稀释成1∶40000工作浓度；

E、发光溶液：使用400ul TMB溶液、10ml pH＝5.0的柠檬酸缓冲液和2ul 30％的H₂O₂溶液混合而成，其中TMB溶液由10mgTMB+2ml DMSO混合而成；

F、洗涤溶液：为pH＝7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，其中含有吐温-20体积分数0.05％；所述的磷酸盐用磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制。

G、包被溶液：1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L水中制成的溶液，调节pH＝9.5；

H、封闭溶液：10g OVA溶于1L洗涤溶液中，再加入质量分数为0.05％NaN₃制成。

以上所述偶联物的载体蛋白为分子量范围在6.7KDa～6.8KDa的牛血清蛋白或卵清蛋白。包被酶标板的包被抗原由酸性橙Ⅱ与卵清蛋白偶合制成，制备抗体的人工免疫原由酸性橙Ⅱ与牛血清蛋白偶合制成。

所述包被抗原浓度为1μg/mL。

所述的试剂盒对酸性橙Ⅱ的最大检测范围为0.1ng/mL～10ng/mL。

本发明试剂盒中涉及的相关溶液的配制

1、本发明中酶标板的制备