[发明专利]一种用于检测人偏肺病毒核酸的引物和探针序列

说明书

技术领域

本发明涉及人偏肺病毒核酸real-time RT-PCR检测的引物和探针序列。 

背景技术

人偏肺病毒(hMPV)为单股负链RNA病毒，属副粘病毒科肺病毒亚科，是荷兰学者Vanden Hoogen等人于2001年发现的一种新的人类呼吸道病毒，基于基因组测序和系统进化分析，hMPV有A、B两个基因型，引起的临床症状和体征主要包括流涕，咳嗽，咽痛，发热，支气管炎，肺炎，结膜炎，中耳炎等，婴幼儿、老人和免疫缺陷者为易感人群。hMPV发现后，在欧洲、澳大利亚、美洲、亚洲等国相继有报道hMPV感染的情况，提示该病毒是世界范围普遍存在的人类致病原。同时，荷兰1958年的血清标本检测表明，hMPV至少在人群中传播至少有50年的历史。hMPV作为一种“新出现的传染病病原体”，从目前关于临床表现较少且不完整的资料来看，hMPV是人类急性呼吸道感染重要的致病原，也是社区获得性急性呼吸道感染的致病原，其在婴幼儿下呼吸道感染中占5.5％-43.0％，特别是1岁以下儿童常发生急性重症下呼吸道感染，成为仅次于RSV的导致儿童住院的重要病原，已经引起世界各国微生物学家和临床工作者的重视，其流行病学特点，进化，传播，临床表现及致病机理等成为呼吸道病毒中的研究焦点之一。 

由于hMPV在培养呼吸道病毒的大部分细胞中不增殖，其敏感细胞较少，且复制缓慢，不出现典型的CPE，所以要求hMPV的分子生物学检测技术不断完善和提高。Van den Hoogen最先利用了RT-PCR技术对hMPV进行检测，该技术快速、灵敏并能在感染早期对病毒进行检测，且不依赖于病毒和细胞的状态，已以成为研究和诊断hMPV感染的主要手段，但由于具有定量不准确，假阳性高，重复性差，劳动强度大等不足，使其应用受到限制。1996年，美国Applied Biosystem公司推出实时荧光定量PCR技术，实现了PCR从定性到定量的飞越。所谓实时荧光定量PCR就是在反应体系中引入荧光集团，对每一个循环扩增产物的累积情况进行实时监测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其特点为全封闭(污染少)，高精确，高灵敏，重复性好，结果可定量，有宽泛的动力学范围(10-10¹⁰拷贝)【39】，因而越来越成为呼吸道病毒检测的主流方法。 

然而，无论是普通RT-PCR，还是荧光定量PCR，都面临针对不同基因扩增的检出率差异的问题。目前针对hMPV研究中N、L、M和F基因都被作为扩增靶基因，但由于hMPV有2个基因型，，如果引物设计不合理，可能导致hMPV的检出率不准确。有研究认为，建立在L基因的保守序列的RT-PCR，比细胞分离鉴定敏感10-100倍，也可以区分hMPV的不同基因型。另外，也有人认为，建立在N基因上的RT-PCR可能更敏感。所以Cotes等认为建立在N基因和L基因上的RT-PCR最适合hMPV的检测，Maertzdorf等则证明建立在N基因上的引物由于错配可能对于B型的病毒的敏感度较低。 

发明内容

综上所述，目前还没有一种既快速，又能全面准确地检测hMPV的方法。因此，本发明的目的是：寻找可以在临床样本中全面准确地获得hMPV阳性结果的real-timeRT-PCR检测方法。 

本发明可以通过以下方法和原则实现：①以目前已经公开发表的针对hMPV保守基因N基因和L基因的real-time RT-PCR检测的引物探针为基础；②分别以经选择和优化的针对N基因和L基因的引物和探针，对临床样本同时进行检测，将检测结果进行对比；③将两种方法检测不相符的阳性样本，针对荧光定量PCR扩增区域进行覆盖扩增，获得测序后进行序列比对；④应用生物信息学手段将代表性差异结果的荧光定量PCR扩增区序列与GenBank数据库中hMPV的A1、A2、B1、B2各型的相应区域进行比对，寻找差异结果与各型毒株在相应序列的差别特征，寻找其中核苷酸的变异规律；⑤最终通过核苷酸简并，确定能够检出A、B两种基因型的引物和探针序列。 

具体实施方式

1.引物探针的选择与优化： 

针对N基因的引物探针序列选择了与应用最多的由荷兰学者Van den Hoogen首次报道的001株(其GenBank登录号为af371337)同源的序列，其中探针使用MGB探针技术，缩短了寡核苷酸数量，增加了探针特异型并提高了Tm值，适合于hMPV基因组T/A丰富、G/C含量较低的特征(图1)。其组合如下： 

上游引物：CATCAGGTAATATCCCACAAAATCAG