[发明专利]一种鱼类RF神经肽基因、编码的蛋白质及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种鱼类RF神经肽基因、编码的蛋白质及其应用。

背景技术

RF神经肽是一类碳末端为Arg-Phe-NH2(RF-amide)的短肽，它们首先在软体动物中发现并证明在无脊椎动物中大量存在。而在脊椎动物中仅存在五种RF神经肽编码基因：PrRP、NPFF(PQRP)、LPXRFa、Kisspeptin和26RFa。这些神经肽具有广泛的功能，其中包括调节肌肉的收缩以及心血管功能、水分平衡代谢、神经内分泌等作用。随着对RF神经肽家族研究的进一步深入，现在认为这一神经肽家族在调节摄食和能量代谢方面具有重要的功能。

2003年，人们首先从食用蛙(Rana esculenta)脑匀浆液中分离纯化了26RFa并在哺乳类中克隆了编码26RFa蛋白前体序列。2006年，在小鼠脑匀浆液中分离得到了另一种形式的成熟肽，命名为QRFP。26RFa和QRFP是由蛋白酶在不同的位置切割26RFa/QRFP前体而产生的。26RFa/QRFP激活G蛋白偶联的受体GPR103。大鼠26RFa/QRFP及其受体主要在下丘脑的侧结核和背腹核团中表达。这些核团在控制摄食行为和调节能量代谢扮演重要角色。在缺失瘦素(ob/ob)或瘦素受体(db/db)小鼠，下丘脑中26RFa/QRFP基因的表达量显著上升。大鼠禁食48小时后，26RFa/QRFP基因在下丘脑的表达也会显著上升。脑室注射26RFa/QRFP能以剂量依存的方式促进大鼠摄食；连续注射QRFP两周能够增强大鼠摄食欲望，增加大鼠体重。用26RFa孵育大鼠脑垂体，第二信使cAMP的含量显著升高。离体和在体研究表明，26RFa/QRFP能够刺激雌性大鼠LH的释放。因此，26RFa/QRFP在控制摄食行为和调节脑垂体激素的释放有重要作用。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术的不足，提供一种可以调控鱼类生殖的鱼类RF神经肽基因。

本发明另一目的在于提供上述鱼类RF神经肽基因编码的蛋白质。

本发明另一目的在于提供上述鱼类RF神经肽基因的应用。

本发明还有一个目的在于提供上述鱼类RF神经肽基因编码的蛋白质的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

通过分析鱼类基因组和EST数据库，我们在多种鱼类中发现编码26RFa蛋白前体序列。根据这些序列设计简并引物，结合RACE技术，我们在金鱼中分离得到26RFa cDNA序列。金鱼26RFa cDNA全长862bp，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示，其中开放读码框为507bp，5′非翻译区为123bp，3′非翻译区为232bp。它编码的26RFa蛋白前体为168个氨基酸，等电点为6.53，分子量为28.31千道尔顿，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其中N-端信号肽由30个氨基酸组成，成熟肽26RFa和7RFa位于蛋白前体的C-端，其氨基酸序列分别如SEQID NO：3～4所示。

序列比对分析表明，26RFa蛋白前体在不同脊椎动物中序列变异较大，成熟肽和蛋白前体断裂识别位点的氨基酸序列相对来说较为保守。从不同的断裂识别位点剪切蛋白前体可能产生不同的成熟肽。在金鱼，断裂26RFa蛋白前体产生26RFa和7RFa两种成熟肽。不同物种26RFa蛋白前体产生的成熟肽C-末端都存在保守的GGFXFRF-amide(X＝G，S，A or N)结构，表明这些氨基酸可能是成熟肽发挥功能的核心序列。

采用Real-time PCR检测金鱼26RFa在各种组织中的表达，结果显示26RFa在下丘脑、视顶盖-丘脑及精巢中表达最高，在端脑、小脑、延脑、肾脏、肝脏、垂体和心脏等组织也有表达，而在卵巢和脂肪组织中没有表达。

本发明鱼类RF神经肽基因可以用于鱼类生殖调控。

用Real-time PCR检测金鱼26RFa基因在饥饿状态下的变化，结果表明：在饥饿四天后，下丘脑中26RFa基因的表达量也显著高于对照组(P＜0.05)。采用腹腔注射方式研究化学合成的金鱼26RFa对金鱼摄食的影响，结果表明：100ng/gBW和500ng/gBW 26RFa注射组能够增加金鱼的在注射后1小时的摄食量。

因此，本发明鱼类RF神经肽基因编码的蛋白质可以用于调节鱼类摄食或制作鱼类人工饲料。