[发明专利]一种山羊产羔性状的分子标记选择方法

权利要求书

1. 一种山羊产羔性状的分子标记选择方法，其特征在于，包括下列步骤：

1）以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用引物P1和P2在PCR条件下进行扩增，筛查山羊KITL基因内含子1和6的碱基突变；

所述的引物P1如下：

上游引物1F：5′- TTCCTATGAGGTTACCAATG -3′；

下游引物1R：5'- GTAGGCTAAACCTTGTCTTGT -3'。

所述的引物P2如下：

上游引物2F：5′- AGAGTTCACAAGACAAGGTT -3′；

下游引物2R：5'- ATTAGGTTACTGGCGTTATG -3'；

所述的PCR扩增的条件是：15μL反应体系，包括：10μmol/L的引物P1、P2的上下游引物各0.6 μL；2×Reaction Mix 5.825 μL；DNA Polymerase 0.125μL（2.5 U/μL）；50 ng/μL DNA 模板0.6 μL；超纯水7.25 μL。

所述的PCR扩增反应程序如下：

利用引物P1的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30s，49.6℃退火40s，72℃延伸40s，共进行36个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；

利用引物P2的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30s，56.7℃退火35s，72℃延伸35s，共进行36个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；

2）根据琼脂糖凝胶电泳对引物P1和引物P2的PCR扩增产物进行大小判定，用限制性内切酶CviAⅡ消化引物P1的PCR扩增产物之后，再采用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切后的扩增片段，发现引物P1的PCR扩增产物存在2个碱基的突变，即316bp处有一个T→C的突变L1位点，363bp处有一个G→T的突变L2位点；采用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测P2的PCR扩增产物，引物P2扩增产物存在1个碱基的突变，即249bp处有一个G→C的突变L3位点；

3）对引物P1和引物P2的PCR扩增产物进行基因分型和基因频率分析，以及与关中奶山羊、西农萨能奶山羊和布尔山羊的产羔数之间进行关联分析结果如下：

在L1位点，纯合型T₁T₁在316bp位的碱基是T，杂合型T₁C₁在316bp位的碱基是T/C，纯合型C₁C₁在316bp位的碱基是C；

在L2位点，纯合型G₂G₂在363bp位的碱基是G，杂合型G₂T₂在363bp位的碱基是G/T，纯合型T₂T₂在363bp位的碱基是T；

在L3位点，纯合型G₃G₃在249bp位的碱基是G，杂合型G₃C₃在249bp位的碱基是G/C，纯合型C₃C₃在249bp位的碱基是C。