[发明专利]樱桃S基因型的快速鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速、低成本鉴定樱桃S基因型的方法。

背景技术

樱桃S基因型的鉴定，均需要提取樱桃基因组DNA，现有技术常采用CTAB法提取，具体步骤如下：

1.将樱桃叶片去掉主要脉络后加液氮研磨(可加入适量石英砂)成细粉状，分装到1.5ml离心管中。

2.加入600μl预热CTAB提取液(Tris 100mM，NaCl 1.4M，EDTA 20mM，2％CTAB，2％PVP，pH 8.0)和2％巯基乙醇(现用现加)，混匀，65℃水浴2-4h，期间可颠倒混匀几次。

3.取出离心管，12000rpm离心10min。

4.取上清，加600μl氯仿，混匀，12000rpm离心5min。

5.取上清，2V预冷无水乙醇沉淀，用灭菌牙签将沉淀挑出，晾干后溶于400μl TE溶液(10mmol/l Tris·Cl，1mmol/lEDTA，pH 8.0)。

6.加入2μlRNaseA(10mg/ml)，37℃2h。

7.加400μl酚/氯仿(1∶1)，混匀，12000rpm离心5min。

8.重复一次。

9.取上清，加500μl氯仿，混匀，12000rpm离心5min。

10.取上清，2V预冷无水乙醇沉淀，12000rpm离心5min。

11.用75％乙醇吹洗沉淀，12000rpm离心3min。

12.弃掉液体，12000rpm离心2min。

13.将多余液体吸出，真空干燥5-10min。

14.将干燥后的沉淀溶于40μl TE溶液(同上)中，备用。

问题在于，现有技术的这种提取方法效率很低，需要5-7小时。

而后针对樱桃S基因型进行PCR反应，对PCR产物进行凝胶电泳及成像鉴定，问题在于，现有技术的PCR反应成本较高。

发明内容

本发明针对上述问题，以现代生物技术为基础，旨在提供一种鉴定范围较广、操作简便、速度快、成本低的樱桃S基因型快速鉴定方法，从而为栽培樱桃合理的配置授粉树，实现樱桃自交亲和育种，并未为樱桃自交亲和新品种育种提供理想的种质资源，为鉴定更多的S基因包括S4’基因等提供有效方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种鉴定樱桃S基因的方法，包括如下步骤：

步骤S1：樱桃基因组DNA提取技术，具体过程包括：

a取100-200mg已经去掉主要脉络的樱桃叶片、加1-2mg石英砂在液氮辅助下研磨成粉末状，移入1.5ml Eppendorf管中，加入600μl缓冲液，混匀；4℃，12000rpm，离心5分钟；

b取上清，加入体积比25∶24∶1的酚∶氯仿∶异戊醇溶液，混匀，4℃，12000rpm，离心5分钟；

c取上清，加入体积比24∶1的氯仿∶异戊醇溶液，混匀，4℃，12000rpm，离心5分钟。重复1-2次，以蛋白层不出现为止；

d取水相，加2.5倍体积的无水乙醇和1/10体积3mol/L pH5.3NaAc，混匀。-20℃放置0.5小时。4℃，12000rpm，离心5分钟；

e弃上清，用70％无水乙醇洗沉淀1次；

f室温下干燥后，溶于30-50μl TE或DEPC水中，-20℃或-70℃保存备用。步骤S2：制备AS-PCR体系：

10×PCR Buffer 2.5μL，浓度25mmol·L^-1的MgCl2 1μL，

浓度2.5mmol·L^-1的dNTPs 0.5μL，

序列为5’-ACTTGTTCTTGGTTTCGCTTTCTTC-3’浓度为10μmol·L^-1的上游引物1μL，

序列为5’-CATGGATGGTGAAGTATTGTAATGG-3’浓度为10μmol·L^-1的下游引物1μL，

50～100ng的DNA 2μL，

浓度5U·μL^-1的Taq DNA聚合酶0.3μL，

PCR反应总体积25μL；

步骤S3：AS-PCR反应程序：

预变性94℃3min；94℃变性1min，退火54℃1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min；