[发明专利]一种表达鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的重组杆状病毒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的重组杆状病毒及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis，IB)是由冠状病毒科(Coronavirndae)、冠状病毒属(Coronavirus)的传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡的呼吸系统、消化系统以及泌尿生殖系统，引起鸡咳嗽、喷嚏、气管罗音、呼吸困难、肠炎、产蛋数量和质量下降等症状。各种日龄、性别的鸡均易感染，但主要侵害1～4W雏鸡，死亡率高达40％～90％。该病引起饲料报酬降低，死淘率增加，饲养效益低所致损失甚至大于鸡的死亡损失，对养鸡业造成重大危害。目前，该病已呈世界范围流行，成为严重危害世界养禽业的重大传染病之一。

IBV是冠状病毒科的代表株，其基因组为不分节段的正链单股RNA，长约27.6kb。病毒基因组RNA共编码3种结构蛋白：纤突蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)、纤突蛋白(S)。S蛋白是IBV在免疫学上重要的蛋白。S蛋白与宿主细胞纤突上受体的结合是IBV吸附细胞的前提条件，其作用表现为：刺激机体产生中和抗体、决定病毒的组织嗜性；在病毒与细胞吸附过程中起重要作用；在病毒血清学分类中起重要作用。

由于IBV血清型繁多(已发现20多个血清型)，流行因素复杂，为有效控制其发生，急需做好该病的早期诊断和疫情监测，其主要方法是用适当抗原检测鸡血清中的特异性抗体。我国已建立了以全病毒为抗原的间接ELISA(I-ELSIA)和血凝抑制试验等方法检测鸡群IBV抗体，但这些方法不适合大批检疫和基层使用，且用活病毒作为抗原易散毒。

与原核表达系统相比，杆状病毒表达系统可以对外源蛋白进行多种翻译后加工和修饰，表达重组蛋白更接近天然结构。为此，本研究采用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统对传染性支气管炎病毒S基因进行表达，构建了含有S基因完整开放阅读框的重组杆状病毒。将重组杆状病毒浓缩后作为包被抗原，制备ELISA检测试剂盒，检测血清中IBV的抗体水平。

发明内容

本发明提供一种表达鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的重组杆状病毒及其用于检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的应用，采用该重组杆状病毒进行检测，适合大批检疫和基层使用，并且避免了活病毒作为抗原易散毒的危险。

本发明提供一种表达鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的重组杆状病毒，由以下方法制备：

(1)获得S基因(纤突蛋白基因)：从感染病毒DS10的鸡胚的尿囊液中提取RNA，以该RNA为模板，采用下游引物SR进行反转录，获得cDNA；以该cDNA为模板，采用上游引物SF、下游引物SR进行PCR反应，获得鸡传染性支气管炎病毒S基因；

所述上游引物SF为5’-CGGGATCCATGTTGGGGAAGTCACTGTTTTT-3’

所述下游引物SR我5’-CCGTCGACTTA AACAGACTTTTTCGGTCTGTATTG-3’；

(2)构建及鉴定重组转移载体pFastBacI-S：将所述S基因插入pFastBacI载体，然后转化入DH5α感受态细胞，采用抗生素平板筛选获得重组子，将该重组子进行酶切，然后电泳，鉴定为阳性的重组子所含有的重组质粒即为重组转移载体pFastBacI-S；

(3)构建及鉴定重组穿梭载体AcIBV-S Bacmid：将重组转移载体pFastBacI-S转化进含穿梭质粒Bacmid的DH10Bac细胞，经蓝白斑筛选获得含有重组S Bacmid 的DH10Bac细胞；提取重组S Bacmid的DNA，采用M13上游引物和下游引物进行PCR，电泳后鉴定为阳性的，则该重组S Bacmid为重组穿梭载体AcIBV-S Bacmind (如图2所示)；

所述M13上游引物为5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

所述M13下游引物为5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’；

(4)重组穿梭载体AcIBV-S Bacmid感染Sf9昆虫细胞，获得表达鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的重组杆状病毒vAcIBV-S。

本发明还提供所述重组杆状病毒在检测鸡传染性支气管炎病毒抗体方面的应用。