[发明专利]鸭源性冠状病毒N蛋白基因及其克隆方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种鸭源性冠状病毒ZZ2004的N蛋白基因及其克隆方法与应用。

背景技术

1937年，冠状病毒(Coronaviruses)首先从鸡身上分离出来。1965年，分离出第一株人的冠状病毒。由于在电子显微镜下可观察到其外膜上有明显的棒状粒子突起，使其形态看上去像中世纪欧洲帝王的皇冠，因此命名为“冠状病毒”。根据病毒的血清学特点和核苷酸序列的差异，目前冠状病毒科分为冠状病毒和环曲病毒两个属。冠状病毒科的代表株为禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)。该病毒为有囊膜、呈中等多形性球状或椭圆形的病毒粒子，表面有杆状突起。

禽传染性支气管炎(IB)是由冠状病毒科的禽传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种常见多发的急性高度接触性传染病，表现为呼吸型、肾型、肠型、腺胃型等多种病型。该病可感染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低。IBV往往引起复合感染，如新城疫(Newcastle Disease，ND)、慢性呼吸道病(CRD)等，并可继发细菌性疾病，如大肠杆菌病、沙门氏菌病等，从而加重了对鸡群的危害。据《世界家禽》1999年资料，全世界的禽病中，以呼吸系统疾病最为严重，其中IB是世界大多数地区危害养鸡业的主要疾病。1988年以来，IB在我国大部分地区相继流行，疫区的发病率可达100％，死亡率可达10～30％。国内外已报道的IBV有26种以上血清型，因血清型及新变型众多，不同血清型之间缺乏交叉保护，新的变异株不断出现和流行，是造成鸡群免疫失败的原因。这使得IB对养鸡业造成的威胁持续存在。而掌握流行毒株的生物学特性和流行特点是正确使用疫苗的前提。

2004年5月，河南省郑州某养殖场发生了以腹泻和生长迟缓为主要症状的疑似IB疾病，感染鸡主要表现精神沉郁，下痢，生长缓慢及抵抗力下降，发病率为100％，死亡率达20％以上，感染鸡群的生产性能显著降低。调查中显示，与鸡舍相距仅150米左右处有一个1700只的肉鸭群，在第一批鸡发病前约10天左右鸭群发生过类似症状的疾病，但没有造成大量死亡。死亡鸡病变主要为小肠出血，肠壁变薄，有的有溃荡，小肠绒毛脱落，腺胃乳头肿大、粘膜脱落，有的肌胃和腺胃交界处有出血，肌胃有出血或溃荡，肾脏肿大，呈“花斑肾”，肺脏无明显变化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎缩；病鸭剖检以肾脏肿大，苍白兼有出血、腿肌及肝脏出血为主要特征。在同地区的其他鸡场也发生了同样症状的疾病，虽然经过多种IBV疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技学院动物科学学院开展了对该疫病的研究工作，结果从发病鸭体内分离到一株病毒，鉴定为IBV，命名为鸭源性冠状病毒ZZ2004株，保藏编号为CGMCC NO.3842，其专利申请号为201010225577.4，此为第一次有关家鸭感染IBV的报道。

IBV粒子含有3种特异性蛋白，即核衣壳蛋白(N)，膜蛋白(M)和纤突蛋白(S)。N蛋白全长约409个氨基酸，分子量约51kDa，占病毒总蛋白量的40％，是IBV病毒内部核衣壳的组成蛋白，它与病毒RNA结合，为螺旋形的核衣壳提供基础。核蛋白在组内高度保守，但近年的研究表明，在不同毒株间N基因存在变异，并且这些差异存在于推测的抗原表位和功能相关区域，提示不同1BV毒株N基因之间的变异可能影响到病毒的某些生物特性发生改变。N蛋白具有较好的免疫原性，在细胞免疫和体液免疫中起重要作用，在局部免疫方面也具有重要作用，因此深入研究N蛋白基因的结构及其变异规律，对于揭示IBV的变异机制，研制高效的IBV疫苗，为有效防控IB的发生将具有起到重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是对鸭源性冠状病毒ZZ2004的N蛋白基因进行了分析测序，并给出了克隆该N蛋白基因的方法及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种鸭源性冠状病毒(ZZ2004，其保藏编号为CGMCC NO.3842)的N蛋白基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

一种鸭源性冠状病毒的(ZZ2004，其保藏编号为CGMCC NO.3842)N蛋白基因，该基因的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

一种鸭源性冠状病毒(ZZ2004，其保藏编号为CGMCC NO.3842)的N蛋白基因的克隆方法，包括以下步骤：