[发明专利]一种评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法

权利要求书

1.一种评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，其特征在于评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法按以下步骤实现：一、将待评价的嗜酸乳杆菌培养到对数生长后期，离心后弃去上清，用冷的PBS洗3次，然后用DMEM细胞培养液重悬菌体，得菌浓度为3×10⁸cfu/ml的菌悬液；二、将极化状态的人结肠腺癌细胞Caco-2用PBS洗2次，然后加入1ml的菌悬液作为实验组，加入1ml的DMEM细胞培养液作为空白对照组，在37℃、5％CO₂的培养箱里共同孵育2h；三、采用Trizol法抽提实验组和空白对照组孵育后的人结肠腺癌细胞Caco-2的总RNA，再提取蛋白质；四、利用Real Time RT-PCR法和Western blot法对免疫调节相关基因的表达情况分别在总RNA和蛋白质水平进行检测，检测结果通过与表1和表2中各免疫调节相关基因的表达上调或表达下调情况及生物学功能进行比对，即可评价嗜酸乳杆菌是否具有免疫调节作用；

表1

表2

其中步骤四中评价嗜酸乳杆菌是否具有免疫调节作用的标准：若总RNA和蛋白质水平检测结果与表1中各免疫调节相关基因的表达上调或表达下调情况全部吻合，则待评价的嗜酸乳杆菌具有免疫调节作用；若总RNA和蛋白质检测结果与表1中免疫调节相关基因的表达上调或表达下调情况只有部分符合的话，则对不符合的基因参照表2中免疫调节相关基因的生物学功能来评价是否会产生不良的生物学效应，若不产生不良的生物学效应，则待评价的嗜酸乳杆菌仍具有免疫调节作用；若产生不良的生物学效应，则待评价的嗜酸乳杆菌不具有免疫调节作用。

2.根据权利要求1所述的一种评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，其特征在于离心是以5000r/min的转速离心10min。

3.根据权利要求1所述的一种评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，其特征在于步骤二中极化状态的人结肠腺癌细胞Caco-2的培养过程：a、人结肠腺癌细胞Caco-2用细胞生长培养液培养，隔天换液，5天传代；b、将生长状态良好的人结肠腺癌细胞Caco-2以3×10⁵cells/cm²的初始量接种于六孔细胞培养板上，在37℃、5％CO₂培养箱下连续培养15天，即获得极化状态的人结肠腺癌细胞Caco-2；其中步骤a中细胞生长培养液由90ml的DMEM细胞培养液、10ml的胎牛血清、1g的青霉素钠和1g的链霉素组成。

4.根据权利要求1所述的一种评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，其特征在于步骤三中采用Trizol法抽提实验组和空白对照组孵育后的人结肠腺癌细胞Caco-2的总RNA的过程：1、人结肠腺癌细胞Caco-2加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解；2、以12000r/min离心5min，弃沉淀；3、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min；4、4℃、12000r/min离心15min；5、吸取上层水相，至另一离心管中，若同时提取RNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相；6、按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min；7、4℃、12000r/min离心10min，弃上清，RNA沉于管底；8、按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，振荡离心管，悬浮沉淀；9、4℃、8000r/min离心5min，弃上清；10、室温晾干或真空干燥5-10min，即完成。

5.根据权利要求1所述的一种评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，其特征在于步骤三中提取蛋白质的过程：1、实验组和空白对照组的人结肠腺癌细胞Caco-2加入冰的200ul细胞裂解液冰上作用30min，刮取细胞于离心管中；2、4℃、14000r/min离心15min后，吸取上层澄清液，即为细胞蛋白质；3、紫外分光光度计测定实验组和空白对照组的总蛋白浓度，并调节浓度一致。