[发明专利]基于量子点荧光检测的酶芯片及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，特别是涉及基于量子点荧光多酶联合检测的酶芯片、基于量子点荧光检测酶反应底物的酶芯片及基于量子点荧光检测酶活性的酶芯片及其上述酶芯片的制备方法和应用。

背景技术

在众多的早期快速检测手段中，生物芯片是近年来发展最为迅速并被认为最有产业化前景的一种检测器件，它具有非常明显的优点，集成、并行、快速检测等等。酶芯片是生物芯片的一种，它是通过酶分子与相应底物的结合反应来进行检测，因此具有高专一性、低费用、操作安全、便于现场测定等优点。因为人体的各种生理变化很多与酶反应相关，所以酶芯片可以用于多种疾病的检测。

γ-谷氨酰转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶(LDH)和碱性磷酸酶(ALP)等酶活性检测是血液化验中常有的指标，具有很重要的临床意义。例如：γ-谷氨酰转移酶的主要功能是参与体内蛋白质代谢，且广泛存在于人体各组织及器官中，以肾脏最为丰富，其次是胰肝等处。在胆汁淤积、炎症等刺激下肝合成GGT增加，因此大多数肝胆疾病血清GGT活动可有不同程度的增加。酒精性肝硬化及胆汁性肝硬化时，GGT明显升高，可达正常的5～10倍。重型肝炎、晚期肝硬化，由于微粒体破坏、酶合成减少，GGT因而下降。各种原因引起的肝内胆汁淤积、肝外胆道梗阻，GGT均明显增高，可达400国际单位/升以上。肝癌时，由于癌细胞逆分化，类似胚胎期，此酶的生成增加，故血清GGT也呈中度或高度升高，临床上也常把此酶作为观察慢性肝炎伴肝硬化病人是否转为肝癌的参考指标。乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶，乳酸脱氢酶存在于机体所有组织细胞的胞质内，其中以肾脏含量较高。急性心肌梗塞发作后，早期血清中LDH活性升高；肝炎、急性肝细胞损伤及骨骼肌损伤时LDH都会升高。患活动性风湿性心脏病、急性病毒性心肌炎、溶血性贫血、肾坏死等病LDH也可升高。碱性磷酸酶是一种磷酸单酯酶，广泛存在于人体组织和体液中，以骨、肝、乳腺、肠粘膜、肾，胎盘中。阻塞性黄疸、肝硬化、肝坏死，碱性磷酸酶明显升高(肝细胞性黄疸则升高不明显)；原发性和继发性肝癌时碱性磷酸酶亦明显升高，与癌组织中或癌肿周围肝细胞合成碱性磷酸酶增加有关；其他肿瘤如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、骨细胞瘤、骨肉瘤等，碱性磷酸酶增高时，提示可能有肝脏转移。因此γ-谷氨酰转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(ALP)的单一或联合检测可以实现癌症的早期诊断(S.L.Liang，D.W.Chan，Clinica Chimica Acta 2007，381，93-97)。

由于酶反应具有很强的专一性，酶蛋白往往较抗体、抗原或基因蛋白等易于获得且生物活性相对稳定，酶反应的底物一般都是小分子的有机物，容易获得、价格便宜，所以构建检测酶类标志物的芯片将更为方便和价廉，易于促进重大疾病早期诊断的普及化和家庭化，从而提高重大疾病的治愈率。

在生物芯片的检测中，通过荧光标记法进行检测是常用的方法。目前，应用最为普遍的荧光物质是有机染料，在大多数情况下，由于它们的激发光谱都较窄，所以很难同时激发多种组分，而其荧光特征谱又较宽，并且分布不对称，这给区分不同物质的荧光带来麻烦，因此要同时检测多种组分较为困难。有机染料最严重的缺陷还是光化学稳定性差，光漂白与光解使每个染料分子能够发出的荧光光子平均数量不多，光解产物又往往会对生物体产生杀伤作用。近年来，量子点由于其特殊的光学和电学性质，已成为生化领域的研究热点之一。与有机荧光染料相比，量子点有以下优点：(1)荧光发射比较稳定，其发光寿命可达ms级，且不易被光漂白；(2)荧光发射强度高，谱峰窄，峰形对称；(3)发射波长随粒径的增大而有规律地红移，改变粒径就可获得多色发光；(4)其激发谱在吸收阈值以上几乎是连续的，有利于多波长激发。因而量子点有望取代有机染料应用于生物芯片。目前量子点已被应用于生物芯片的组装(S.Sabella，G.Vecchio，R.Cingolani，R.Rinaldi，P.P.Pompa，Langmuir，2008，24，13266-13269)，曾有报道组装利用荧光原理检测蛋白激酶的酶芯片(C.B.Cohen，E.C.Dixon，S.Jeong，T.T.Nikiforov，Analytical Biochemistry，1999，273，89-97)，但所用的荧光物质是有机染料。虽然近几年量子点荧光检测的报道不断增多，但用于检测酶类疾病标记物的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供基于量子点荧光检测的酶芯片，该酶芯片可单一检测或同时检测两种以上的酶活性和/或酶反应底物的浓度。