[发明专利]一种提高人种间核移植胚胎核质相容性及发育率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及胚胎工程与发育生物学领域，更具体地，涉及一种提高人种间核移植胚胎核质相容性及发育率的方法。

背景技术

核移植(Nuclear transfer, NT)是研究核质互作关系中诸多重要问题的最有效方法。应用不同分化程度的细胞核移入去核卵母细胞的方法，已经在两栖类动物获得发育完全的个体。在最近的二十年期间，核移植方法在哺乳动物中发展神速，并已开始应用于生产。

大量结果表明，在同种动物之间，把中II期卵母细胞/受精卵作为受体细胞(供质细胞)，把不同分化程度的细胞作为供核细胞，两者所组成的重构胚在移入寄母生殖道后，在牛、羊、猪、兔、猴、小鼠等多种动物中均已获得相应的核移植后代。

将患者体细胞作为供核体移入去核的卵中，以实现核的重编程并发育为囊胚，取囊胚内细胞团细胞用于培养并获得干细胞，此类干细胞简称为核移植胚胎干细胞(nuclear transfer ES, ntES)。ntES细胞可应用于临床移植治疗，这就是所谓的治疗性克隆(Therapeutic cloning，TC)。由于这种来源的干细胞染色体源于患者，植回患者体后在理论上不会引起免疫排斥。这是在体细胞核移植技术和胚胎干细胞制备技术取得重大进展的基础上兴起的新技术，有望解决治疗过程中由异体移植引发的免疫排斥难题，并为建立个体化的ntES细胞库、解决供体ES细胞来源不足等问题，使之能广泛应用于临床奠定基础。目前，在小鼠和牛上，已经获得来自核移植囊胚的ES细胞^[1]或ES样细胞^[2]，而且这些ES细胞与来自受精囊胚的ES细胞的多能性、基因表达谱以及甲基化状态等没有明显的区别^[3]，提示人的核移植ES细胞也可以应用于临床治疗。

然而，因人卵母细胞的供应量有限等多种原因，一种替代方法是使用异种的卵母细胞。以源自两种不同物种的卵母细胞胞质体和核供体的核转移，被定义为种间核移植(interspecies somatic cell nuclear transfer, iSCNT)。iSCNT最重要的预期应用价值也许是它能方便地重编程人的体细胞但不必使用人卵母细胞 ^[4]。其他一些替代取代人卵母细胞的策略，包括所谓的卵共有制(egg sharing)和卵捐赠制(egg donation),但未能被广泛实施并用于研究和治疗开发。另一种替代策略是自人ESCs诱导衍生出具人卵母细胞潜能的卵^[5]，但迄今未能实现。

因此，越来越多的人将注意力转向iSCNT，认为它是一种可行的战略，能满足ESC研究所需的卵母细胞用量。最近，英国政府允许在iSCNT中使用人躯体细胞核作供核体，非人的卵母细胞作受体，以便能彻底探索iSCNT的潜在应用价值。

然而，种间核移植胚胎也存在一些问题，其中包括发育率低及囊胚内细胞多能性不足等。导致这些问题的影响因素众多，其中可能包括：供核细胞与异种卵胞质之间的不相容性致使种间核移植胚胎发育率极低，以及异种间胚胎早期发育事件的差异性使异种卵母细胞不能正确调控人种间核移植的早期发育等^[6]。

另外，供核细胞的发育状态^[7，8，9]、分化状态^{[10，11，12]}、表观遗传状态^[13]影响核移植重构胚胎的发育。细胞长期在体外的环境中传代培养，体外环境会影响供核细胞的发育状态、分化状态、表观遗传状态，使细胞的遗传背景改变或异常^{[14，15，16]}。这种体外长期传代培养的细胞用作供核细胞，导致重构的胚胎发育率或正常发育率低下。

因此，本领域迫切需要开发新的提高人种间核移植胚胎核质相容性和/或发育率的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种提高人种间核移植胚胎核质相容性及发育率的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种提高人种间核移植胚胎的早期发育率的方法，包括步骤：

       (a) 将原代培养获得的人成纤维细胞用作供核细胞，将供核细胞的细胞核移入去除了细胞核的非人哺乳动物中II期卵母细胞的卵周隙内,电刺激促进融合，从而形成重构卵；

       (b) 将来自于人卵的胞质移入步骤(a)的重构卵；

       (c) 对步骤(b)的重构卵进行电刺激，以促进人卵胞质与重构卵的融合，从而形成由人体细胞的细胞核、非人哺乳动物的去核卵胞质、和人卵胞质三种成分组成的重构卵。