[发明专利]玉米体外应用dsRNA抗矮花叶病毒干扰调控技术

说明书

技术领域

本发明涉及生物和现代农业技术应用领域，尤其涉及一种玉米体外应用dsRNA抗矮花叶病毒干扰调控技术。

背景技术

玉米是一种重要的粮食、饲料和工业原料等多用途作物，我国是世界玉米生产第二大国。近年来，随着农业产业化结构的调整，我国玉米种植面积逐年增加，但是玉米病毒病尤以玉米矮花叶病毒(Maize dwarfmosaic，MDM)病危害严重，不但造成玉米的大量减产和品质下降，并且可通过种子传递给后代，造成品种种性退化。玉米矮花叶病主要是通过蚜虫传播，在我国其病原主要是甘蔗花叶病毒的B株系。在黄淮海夏播玉米区发生尤为频繁和严重。目前对这种玉米病毒病的防治，多采用农药来控制传播病毒的蚜虫，从而使植物免受病毒侵染，但农药价格较高、易造成污染、费工费时且防治效果差。通过组织培养脱毒法对防治某些病毒病曾取得一定的成果，但组织脱毒法成本高，工作量大，有效期短。因此，培育推广抗病品种和寻找新方法已成为病毒病防治的迫切需求。

RNA沉默是一种真核生物共有的、转录后水平起作用的同源依赖的基因沉默现象。目前RNAi作为一种高效的反向遗传学手段，已广泛应用于多种动植物的功能基因组研究和代谢途径分析，并且在植物的抗病毒育种中也表现出了巨大的优势，具有抗病性强、抗性持久、抗性植株频率高和生物安全性高，遗传稳定等优点，成为植物抗病毒基因工程的热点。目前利用病毒目的基因如外壳蛋白(CP)基因、复制酶基因和运动蛋白基因等进行抗病基因工程研究已经取得了一定的成果。应用RNA介导的干扰技术进行植物抗病毒方面的研究目前主要是利用农杆菌介导的转基因法，而该方法面临着转化体系不成熟，转化频率低，以及转基因后代潜在的风险等，从而限制了抗病基因工程的研究进展。

发明内容

本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供大肠杆菌表达的dsRNA抗玉米矮花叶病毒干扰调控技术，从而诱导植物对病原物产生抗性，可以形成一种防治作物病害的新方法。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

玉米体外应用dsRNA抗矮花叶病毒干扰调控技术，利用RT-PCR扩增玉米矮花叶病毒CP基因两个特异性片段，构建反向重复表达载体LMCP1及LMCP2，利用IPTG诱导表达，在大肠杆菌HT115或DE3中生产抗MDMV的dsRNA，将提取的dsRNA稀释，稀释浓度大于1/15后喷洒三叶期的玉米叶片。

其中，RT-PCR扩增玉米矮花叶病毒CP基因特异性片段，分别正反向插入到pUCCRNAi载体中构建反向重复载体pUCCRNAi+2F，利用PstI-SalI双酶切pUCCRNAi+2F及L4440质粒，并用T4连接酶连接，构建原核表达载体LMCP。

作为本发明的优选技术方案，所述的IPTG浓度为0.6mmol.l^-1，诱导表达的时间为4h。

作为本发明的一种改进，在喷洒的dsRNA稀释液中加入渗透剂，浓度小于10^-2。所述的渗透剂为金尔阿硅。

作为本发明的优选技术方案，所述的渗透剂的浓度为10^-4。

本发明以玉米矮花叶病毒MDMV的外壳蛋白基因的特异性片段为靶目标，开展体外抗病毒RNA干扰调控技术研究，对建立简便高效玉米抗病毒RNAi调控技术体系，创建高抗病毒玉米新种质具有重要的理论和实践意义。

与已有技术相比，本发明有益效果体现在：

1、本发明利用RNA沉默的原理，从病毒RNA中扩增特异性干扰片段，为植物病毒防治提供新思路，避免了其他方法的种种弊端：如环境污染、成本高、工作量大、有效期短等。

2、本发明利用细菌表达的粗体液处理植株，该方法简单，克服转基因的风险，更容易进行大田应用。

3、本发明在筛选最佳处理浓度及处理时间的基础上，为延长dsRNA在叶片上的停留时间以及增加dsRNA的渗透性，配置含不同浓度的渗透剂的dsRNA组合，此法探讨思路新颖。

4、本发明建立玉米体外应用dsRNA诱导抗病毒非转基因RNA干扰调控技术体系和筛选出高效dsRNA干扰制剂，可为玉米病毒病防治提供一种简单、有效和廉价的新方法，也可为其它植物病毒病防治提供借鉴。

附图说明

图1为本发明pUCCRNAi载体图谱。

具体实施方式

1玉米矮花叶病毒CP基因特异性RNAi片段的获得

1.1玉米矮花叶病毒RNA的提取

采用Trizol法提取感染矮花叶病毒病植株的叶片RNA，方法如下：