[发明专利]建兰花叶病毒外壳蛋白基因、重组表达载体及构建方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种建兰花叶病毒(CymMV)外壳蛋白(CP)基因，含有该基因的原核重组表达载体及其构建方法。

(二)背景技术

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，CymMV)是侵染兰花最常见的两种病毒之一。CymMV隶属线形病毒科(Flexiviridae)、马铃薯X病毒属(Potexvirus)，病毒RNA基因组全序列约6～7kb，与该同属的其它成员有很高的同源性。整个基因组由5个开放读码框架(ORF)构成，其中CP基因是完整地ORF5框，长约700nt，编码24kD的外壳蛋白。CymMV给兰花花卉生产带来巨大损失，虽然可以用分子诊断进检测，但是分子诊断需要特殊的分子实验技能，无法大面积推广，只适合在实验室中进行。大量的田间检验及贸易中的检测需要方便、快捷的方法，因此快速检测试剂盒的开发可满足以上要求。在试剂盒开发中，抗体制备是一个关键步骤。通常如果病毒在病组织中的含量低，就不易获得大量高纯度的病毒；且利用提纯病毒制备的抗血清中常含有寄主蛋白的抗体，导致假阳性反应。因此利用原核表达病毒外壳蛋白基因的产物作为抗原可以得到特异性强的抗血清，能部分解决以上问题。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种建兰花叶病毒(CymMV)外壳蛋白(CP)基因、含有该基因的原核重组表达载体及其构建方法。

本发明采用的技术方案是：

一种建兰花叶病毒外壳蛋白基因CymMVCP，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列：

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本发明还涉及一种含所述建兰花叶病毒外壳蛋白基因CymMVCP的原核重组表达载体，由SEQ ID NO.1所示的目的基因CymMVCP插入原核表达载体获得。

本发明关键在于提供了建兰花叶病毒外壳蛋白基因CymMVCP基因序列，在已知该基因序列的情况下，本领域普通技术人员可以方便的获得含有该基因的重组表达载体。

进一步，所述原核表达载体为pET32c，目的基因CymMVCP的插入位点位于EcoR I和HindIII两个酶切位点之间。

具体的，所述原核重组表达载体质粒图谱如图1所示，PCR鉴定结果见图2。

本发明采用的pET32c表达载体是个带有多克隆位点(Polylinker)的载体，多克隆位点的下游含有组氨酸标签，因此外源基因以融合蛋白的形式表达，同时表达的蛋白N端由载体序列编码的6×His标记的蛋白不影响病毒外壳蛋白的免疫原性，由此制备的抗血清特异性也不受影响。

本发明还涉及一种构建所述原核重组表达载体的方法，所述方法包括：以pET32c为原核表达载体，构建含有CymMV外壳蛋白基因的原核表达载体pET32c-CymMV-cp，目的基因CymMVCP的插入位点位于EcoRI和HindIII两个酶切位点之间。

具体的，所述方法如下：