[发明专利]巣式PCR法扩增EGFR基因外显子19片段的方法无效
| 申请号： | 201010271634.2 | 申请日： | 2010-09-03 |
| 公开（公告）号： | CN101988124A | 公开（公告）日： | 2011-03-23 |
| 发明（设计）人： | 蔡燕燕;吴奇涵;顾海英 | 申请（专利权）人： | 华东师范大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 上海伯瑞杰知识产权代理有限公司 31227 | 代理人： | 吴瑾谕 |
| 地址： | 200062 上*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 巣式 pcr 扩增 egfr 基因 外显子 19 片段 方法 | ||
1.巣式PCR法扩增EGFR基因外显子19片段的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）第一轮PCR扩增，以血浆DNA或石蜡切片DNA为模板，扩增25～35个循环，所用的引物为：
C19F：5'-TATCAGCCTTAGGTGCGG-3'，
C19R：5'-GGATGTGGAGATGAGCAGG-3'；
（2） 第二轮PCR扩增，以步骤（1）的第一轮PCR扩增产物为模板，扩增25～35个循环，所用的引物为：
19F：5'-AACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCA -3'，
19R： 5' -CCACACAGCAAAGCAGAAACT- 3'；
且上述步骤（1）和（2）中，两轮PCR扩增的反应条件和步骤为：A. 94～96℃预变性3～6min； B. 93～95℃变性20～40s，59～61℃退火20～40s，71～73℃延伸20～40s，25～35个循环；C. 然后71～73℃延伸3～6min。
2.权利要求1所述巣式PCR法扩增EGFR基因外显子19片段的方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应条件和步骤为：A. 94～96℃预变性5min； B. 93～95℃变性30s，59～61℃退火30s，71～73℃延伸30s，25～35个循环；C. 然后71～73℃延伸5min。
3.权利要求1所述巣式PCR法扩增EGFR基因外显子19片段的方法，其特征在于，步骤（1）中每种引物的浓度分别为0.1～1μM；血浆DNA或石蜡切片DNA的浓度为20～100ng/ml；
反应体系中还包括：
四种脱氧核苷酸，每一种浓度分别为100～400μM；
DNA聚合酶，浓度为；10～100U/ml。
4.权利要求1所述巣式PCR法扩增EGFR基因外显子19片段的方法，其特征在于，步骤（2）中每种引物的浓度分别为0.1～1μM；将步骤（1）第一轮PCR扩增产物稀释10～25倍；
反应体系中还包括：
四种脱氧核苷酸，每一种浓度分别为100～400μM；
DNA聚合酶，浓度为；10～100U/ml。
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