[发明专利]一种血清多肽内标校正检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及血清多肽的检测，具体地说是一种利用质谱对血清多肽进行校正检测的方法。

背景技术

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption lionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技术，是近年来飞速发展的蛋白质组学技术之一，具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学研究与临床重大疾病预警和辅助诊断等提供快速、高同量的分析测试手段，同时也是一种很好的筛选疾病的分子标记方法。

目前的相关研究大多是多维色谱分离与电喷雾离子化源(ESI源)质谱分析联用的应用研究，而对于基质辅助激光解析电离(MALDI)源质谱而言，由于每次实验中样本分离程度、样品在靶上的结晶状况和肽段离子化效率等因素的不同导致实验结果的重现性差，限制了本技术在临床医学实验室的广泛应用。

因为不管是ESI或MALDI离子源，由于分子结构的差异，导致质谱的峰高并不和蛋白量有绝对的关系，同等量不同的蛋白分子，在质谱上的响应是不同的。

到目前为止，还没有能够有效内标校正检测血清多肽技术的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于，针对上述不足提供一种内标校正检测血清多肽的方法。

本发明血清多肽内标校正检测方法是在血清样本中加入已知质荷比峰的多肽，利用质谱检测样本，根据该多肽的质合比峰矫正血清色谱图。这样可以避免血清多肽分子量的漂移。所述质谱优选为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱。

尽管生物质谱具有较高的检测灵敏度，但是其检测能力受复杂环境中高丰度的干扰物质所限制。为此，本发明方法优选还包括采用SPE-C磁珠对血清进行富集。

上述内标可以加入到经SPE-C磁珠富集处理后的样本中，或者直接加入到血清中，然后在经SPE-C磁珠富集处理。前一种方式相对于后一种方式简单更容易实现，并且更容易实现内标和血肽谱峰共同存在，且强度合适。

优选加入的多肽为浓度已知的多肽，这样不仅可以校准质谱图横坐标还可以矫正纵坐标，提高蛋白质分子量和丰度检测的准确度。多肽的浓度可根据样品进行调整，通常以终浓度(50fmol)为宜。

内标的设计，可以采用如下方式进行：插空式，即在已有血肽数据基础上，查看哪些区域没有固有血肽影响，则设计该分子量区间的内标(即内标多肽位于血清多肽指纹图谱的无干扰区域)。

在本发明一个实施例中，选择分子量1964.09Da作为内标肽，进一步还可以将上述内标制备成各种检测试剂盒，以方便使用。

本发明通过在血清样本中添加已知质荷比峰的多肽作为内标，在检测血清样本时用内标进行校正，使得血肽谱中各个峰值更加准确，避免分子量的漂移。

附图说明

图1是经标准品外标校正后的质谱图，其平均分子量偏差小于100ppm；

图2.Mr＝1964.09Da内标自检，浓度＝1fmol/μl。

图3.血清+内标，内标浓度＝100fmol/μl。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本例中，将人血清经SPE-C磁珠处理后的富集液，MALDI-TOF得到的谱图为血清多肽指纹图谱简称血肽谱。在SPE-C磁珠处理后的富集液中加入内标目的是在MALDI-TOF线性采集数据时，外标校正后，用内标再次校正，使得血肽谱中各个峰值更加准确，避免分子量的漂移。

实验目的：

以1964.09作为内标进行校正，优化系统重复性和稳定性。

实验材料：

(1)真空采血管[BD Vacutainer SST(‘tiger-top’)管(Becton Dickinson cat.no.367988)]

(2)聚丙烯EP管(适用于-80℃)

(3)枪头(Eppendorf)

(4)排管(Eppendorf)

(5)分装瓶或管[Eppendorf，Biozym PCR管(#710950)]

(6)溶剂瓶[Nalgene FEP(Teflon)瓶]