[发明专利]FAT10基因siRNA重组模拟病毒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种模拟病毒，特别涉及FAT10基因siRNA重组模拟病毒，还涉及该模拟病毒的制备方法和应用。

背景技术

肝癌是常见的恶性肿瘤，位居恶性肿瘤发病率的第5位，其确切发病机制尚未完全明了。如何阻断慢性肝脏疾病向肝癌的恶性转化，或在肝癌早期加以干预，成为进一步提高肝癌治疗效果的关键。

FAT10又被称为双泛素(diubiquitin)，属于泛素蛋白家族中的泛素样修饰蛋白(UBLs)，是一个分子量为18kDa的包含165个氨基酸残基的蛋白质，由两个泛素样结构域融合而成。FAT10在细胞周期的调控中起到十分重要的作用，已被证明能与人纺锤体聚集检测点蛋白(mitotic arrest deficiency 2，MAD2)非共价结合。MAD2负责在有丝分裂时保持纺锤体的完整性，其功能受到抑制将导致染色体不分离或染色体不稳定，这是许多肿瘤发生的重要特征。已有研究发现，FAT10在肝癌、宫颈癌、卵巢癌、直肠癌、胰腺癌及小肠腺癌等恶性肿瘤中表达均明显上调，表明FAT10在恶性肿瘤的发生中起到一定作用。因此，抑制FAT10的过度表达，可能是调控肝癌基因表达的新途径。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)引发生物体内同源mRNA降解从而表现出的基因转录后沉默现象，现已成为分子生物学家分析基因组功能和基因治疗的一个有力工具。小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)是RNAi的效应分子，是一类长21～23个核苷酸的双链RNA，在体内可特异性降解与其序列互补的mRNA而引发基因沉默。文献(刘天德等.siRNA对肝癌细胞异常表达FAT10基因的抑制效应研究.新医学，2009，40(6)：358)报道了FAT10基因siRNA可以抑制人肝癌细胞株Hep3B中FAT10基因的表达，并抑制Hep3B细胞的生长。但该文献使用的是体外合成的siRNA，而siRNA在体内易被核酸酶降解，稳定性较差，产生的RNAi干扰效应时间短，不适用于长期基因沉默。最好是借助表达质粒或病毒载体等在细胞内持续产生siRNA，例如将编码短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)的模板DNA序列插入载体启动子后构建重组表达载体，所得重组表达载体导入体内后持续转录出shRNA，shRNA再被体内RNaseIII家族的内切核酸酶Dicer剪切成siRNA，从而达到长期抑制靶基因表达的目的。虽然病毒载体介导的RNAi近年来受到人们重点关注，利用病毒载体可以解决质粒转染效率低、效果不稳定且某些类型细胞不能转染等问题，但其也存在诸如免疫原性和病毒性重组等安全性问题，以及制备过程复杂、容量有限、制得的病毒滴度较低等缺陷。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种FAT10基因siRNA重组模拟病毒，可以靶向肝癌细胞并使FAT10基因siRNA局限在肝癌细胞中表达，特异性导致肝癌细胞中的FAT10基因表达沉默，避免损伤无关细胞。

为达到上述目的，本发明的FAT10基因siRNA重组模拟病毒为融合多肽与FAT10基因siRNA重组表达载体的复合物；所述融合多肽由RGD肽与穿膜肽HIV-Tat49-57连接而成；所述FAT10基因siRNA重组表达载体通过甲胎蛋白(AFP)启动子控制FAT10基因siRNA的表达。

进一步，所述融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；

进一步，所述FAT10基因siRNA的核苷酸序列为：正义链如SEQ ID No.1所示，反义链如SEQ ID No.2所示；

进一步，所述FAT10基因siRNA重组表达载体是将核苷酸序列分别如SEQID No.3和SEQ ID No.4所示的2条模板DNA单链经退火处理后插入pSilencer1.0-U6载体的启动子之后而得到；所述pSilencer 1.0-U6载体中的U6启动子被AFP启动子所替换。