[发明专利]抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体可变区的基因序列

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体可变区的基因序列。 

背景技术

溶藻弧菌(Vibrio.alginolyticus)是引起牙鲆、鳗鲡等许多名贵经济鱼类致病的病菌之一，严重威胁着我国水产养殖业的发展。可给渔业和养殖业带来巨大的经济损失。传统防治溶藻弧菌感染的方法主要采用抗生素和减毒、灭活疫苗。抗生素的长期使用可使鱼类产生耐药性，而且残留的抗生素可通过食物链对人类造成危害。减毒疫苗的安全性难以掌握；而用物理、化学方法制备的灭活疫苗，抗原活性可能遭到破坏，且残存的杂质还可能引起鱼的炎症反应而死亡。 

发明内容

本发明的目的是提供抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的基因序列，其可作为抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体(mAb)抗原，为mAb基因工程疫苗的构建奠定基础。 

本发明是通过以下技术方案实现的：针对溶藻弧菌保护性抗原表位制备的抗独特型mAb具有良好的免疫原性和安全性，为此，我们应 用RT-PCR技术，从分泌抗溶藻弧菌独特型mAb的杂交瘤细胞株2F4中，扩增了该mAb的重链可变区基因V_H和轻链可变区基因V_L的基因片段，并进行了克隆和序列测定。其中，V_H基因全长为369bp，编码123个氨基酸；V_L基因全长为339bp，编码113个氨基酸，通过国际联机检索及Kabat库分析，二者均符合小鼠IgG V区基因的特征，含有4个框架区(FR)，3个抗原互补决定区(CDR)及两个抗体特征性的半胱氨酸残基。 

所测抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体重链可变区基因V_H的核苷酸序列为： 

抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体重链可变区基因V_H的氨基酸序列为： 

所测抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体轻链可变区基因V_L的核苷酸序列为： 

所测抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体轻链可变区基因V_L的氨基酸序列为： 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步描述，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照料常规条件，例如基因的RT-PCR扩增或试剂盒按照制造厂商所建议的条件使用。 

抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体重链可变区基因V_H及轻链可变区基因V_L的克隆及序列测定： 

一、基因V_H和V_L的RT-PCR扩增 

1、材料和方法 

1.1材料分泌抗溶藻弧菌独特型mAb杂交瘤细胞株2F4为本室建立；RPMI1640为Gibco BRL公司产品；RNA抽提试剂TRIzol^TMReagents购自Life technology公司；RT-PCR试剂盒为美国invitrogen公司产品；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自上海华舜生物工程公司；PMD18-T vector为Takara产品。 

1.2方法 

1.2.1抗溶藻弧菌独特型mAbV_H和V_L基因的扩增收获6×10⁷分泌抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体杂交瘤细胞，用TRIZOL，氯仿和异丙醇抽提RNA后以无水乙醇沉淀，取10μLRNA为模板，以OligodT为随机引物，反转录合成cDNA。根据Kabat库设计PCR引物。引物的序列如下： 

V_H Back为：5′-CGGCCGAGGTGC(A)AGCTGC(A，G)A(T)GC(G)AGTCTGG(A)GG-3′； 

V_H For为：5′-TCCACCTGTCGACACGGTGACTGAGGTTCC-3′； 

V_L Back为：5′-GACATCCAGATGACACAGAC-3′； 

V_L For为：5′-ACGTTTC(TK)AG(T)C(T)TC CAG(A)CTT G(T)G-3′。