[发明专利]志贺氏菌检测方法及其金标快速诊断试剂盒和制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测志贺氏菌的方法。以及用于该方法的志贺氏菌金标快速诊断试剂盒和其制备方法。

背景技术

志贺氏菌属(Shigella)的细菌通称是痢疾杆菌，是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原微生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，此外，阿米巴原虫、鞭毛虫以及病毒等亦可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿中可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。

志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μm，宽0.5-0.7μm。不形成芽孢，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。DNA的G+C含量为49-53％克每分子(Tm法)。该菌好氧或兼性厌氧，且营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适生长温度为37℃，最适pH为6.4-7.8。37℃培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，宋内氏菌菌落一般较大，不透明，而且经常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成。此菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气。大多不发酵乳糖，仅宋氏菌迟缓发酵乳糖。靛基质产生不定，甲基红阳性，VP实验阴性，不分解尿素，不产生H₂S对甘露醇的分解和产生吲哚的能力因菌种而异。根据生化反应可进行初步分类。

抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原(O)及表面抗原(K)组成。主要抗原有以下三种：

型特异性抗原：型多糖抗原为菌体抗原的一种，是光滑型菌株所含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时，此抗原也常随之消失。各菌型所含的型抗原不同，可用于区别菌种的型别。

群特异性抗原：为光滑型菌株的次要抗原，也是菌体抗原的一种。特异性较低，常在数种近似的菌内出现。在福氏菌株中，由于所含群抗原不同，可将某些菌型分为多种亚型，如福氏菌2型，根据群抗原不同，可分成2a、2b两个亚型。

表面抗原(K抗原)：在新分离的某些菌株菌体表面含有此种抗原。耐热性差，加热100℃1小时即被破坏。具有此种抗原的菌株，可阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集。

人和灵长类是志贺氏菌的适宜宿主，细菌经口感染，且感染仅限于胃肠道，很少侵入血流。营养不良的幼儿、老人及免疫缺陷者更为易感。据报道，每年约有14000例志贺氏菌病，但估计发病人数为30万。

据FDA统计，1997年美国加州等5个州食源性疾病共为8051例，其中志贺氏菌引起的为1263例。

志贺氏菌病常见为食物爆发型或经水传播。志贺氏菌病相关的食品包括色拉(土豆、金枪鱼、虾、通心粉、鸡)，生的蔬菜，奶和奶制品，禽，水果，面包制品，汉堡包及鳍鱼类等。志贺氏菌在拥挤和不卫生条件下可迅速传播。经常发现于人员大量集中的地方，如餐厅、食堂等处。食源性志贺氏菌流行的最主要原因是：从事食品加工行业人员患菌痢或带菌者污染食品。食品接触人员个人卫生差，存放已污染的食品，或食品存放温度不适当等。

志贺氏菌感染具有传染源广、传播速度快等特点，同时该菌的自然来源非常 广泛。目前对其致病机制还不是很清楚。虽然近年来相关检测技术取得了很大的进展，但仍然存在一些缺陷。所以，进一步研究该菌的快速、准确、灵敏的检测方法对食源性致病菌感染的控制、疾病的诊断和流行病学调查非常重要。

本发明采用志贺氏菌免疫家兔或羊，制备多表位抗体。免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。研制一种可适用于现场操作的金标快速诊断试剂盒，本试剂盒可快速(5-20分钟出检测结果)特异性的检测志贺氏菌，而且快速(5-20分钟出结果)，可用于发病现场快速诊断。

本发明的公开

本发明的第一目的是：提供一种志贺氏菌的检测方法。该方法为一步法检测，反应速度快、灵敏度高、特异性强，操作简便，无需专门设备，适用于临床检测、流行病学调查和场地检疫等多种场合。

本发明的第二目的是提供一种志贺氏菌金标快速诊断试剂盒。该试剂盒针对志贺氏菌检测提供一种简便而且直接的一步法检测。利用该试剂盒检测志贺氏菌的反应速度快，灵敏度高，特异性强，操作简便，无需专门设施。

本发明的第三目的是：提供一种志贺氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法。该方法简便、稳定性好、重复性好。

本发明的第一目的可通过如下措施来实现：