[发明专利]一种高通量的大豆转基因方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高通量的大豆转基因及筛选方法。

背景技术

大豆是重要的油料作物，也是植物蛋白质及油脂的重要来源。为了提高大豆抗病虫害及生理逆境的能力、改善大豆品质、增加大豆产量，除了采用传统的育种方法外，可通过基因工程手段实现有目的的遗传工程改良。大豆的遗传转化是研究大豆基因功能的关键，但由于大豆的组织培养体系不够完善，大豆组织对农杆菌不敏感等原因，使大豆的遗传转化难度大、效率低、至今成为世界性难题。

探索大豆转基因方法主要包括基因枪法、农杆菌介导法、电激法、PEG法、子房注射法等，其中以农杆菌介导法和基因枪法为研究较多。农杆菌介导的组培法，存在着遗传转化操作繁琐、成本高、工作量大、周期长、转化率低，而且受到基因型依赖和菌株特异性的限制；基因枪法操作简便、受体广泛、一次可转化多个细胞，但是由于基因整合频率不高，转化基因拷贝数不稳定，也受到基因型的限制，而且需要经过繁琐的组织培养体系才能得到再生植株，特别是其昂贵的设施条件及实施成本限制了广泛的推广应用。目前，大豆转化的主要障碍来自缺乏高效稳定的组培技术体统，因此，创建高效简便的花粉管通道法转化大豆具有重要意义。

花粉管通道法(pollen-tube pathway)是周光宇等(1978年)建立并在长期科学研究中发展起来的一种育种方法，目前已在国内外广泛应用。基本原理是花朵授粉后，花粉管通过珠心插入到胚囊中，外援基因沿着花粉管到达子房，整合到受精但未分化的合子细胞中，此时合子细胞壁尚不完整，处于感受态，易使外援基因转入。该方法无需建立外植体的组培再生体系，在非离体的大豆活体花器官实施基因转化，并通过对后代种子进行筛选，获得转化植株。该方法已在棉花中被广泛应用，在大豆(刘德璞等，申请号99123707.2)中已有成功报道。但是上述大豆花粉管通道转化方法中存在着两大缺陷：一是授粉后转化前需要进行对每朵花序做一一切去柱头处理的大量工作；二是通过繁琐的幼胚组织培养途径筛选或对收获种子经过初选、移植、再复选和分子鉴定等，其筛选程序繁琐、效率低、工作量大、筛选周期长等低效技术问题。因此，难以满足大规模高通量的基因转化与筛选的实际应用要求。同时，剪去柱头的繁琐操作可能导致以下影响：

1、大豆是自花授粉植物，其授粉发育进程并非同步。过早的切去柱头会影响花粉管的正常发育，影响授粉效率，降低胚珠受精机率，导致结实率下降，同时影响DNA分子经花粉管通道进入胚囊。

2、由于大豆花的形态结构特殊，花器中的柱头微小，切柱头的工作要求精细，操作不当容易引起子房受机械损伤，花粉管通道破坏，造成结实率降低，影响转化率。

3、柱头组织微小，切柱头的操作难度增加了繁琐的工作量，难以实现大规模高通量的遗传转化与实际推广应用的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量大豆转基因方法。该方法避免了农杆菌转化方法中繁杂的组织培养体系和转化效率低、周期长、受基因型依赖等问题，同时解决了以往花粉管通道转化大豆方法中需要修剪大量花柱头的操作，以及繁琐的抗性筛选程序及较长的筛选周期等技术缺陷。

本发明提供的大豆转基因方法，包括如下步骤：在大豆花的柱头上滴加基因转化液，成熟后收获种子。

上述基因转化液是含待转基因的质粒悬浮液。

进一步，上述含待转基因的质粒可以是将待转基因插入含Bar基因的pGREEN载体的多克隆位点间得到的重组质粒，具体可以是实施例中的pGREEN0229。

上述基因转化液是将待转基因的质粒置于0.1×SSC缓冲液中，得到所述基因转化液，所述待转基因的质粒在所述基因转化液中含量50-100ug/ml，优选是70ug/ml(也即上述含待转基因的质粒是以50-100ug/ml，优选是70ug/ml的浓度定溶于0.1×SSC缓冲液中的)。

上述含待转基因的质粒悬浮液滴加在所述柱头的体积是5-8μl。具体可以以在柱头上形成一最大液滴而不落下为最佳。

上述大豆花选择生长状态良好、发育健壮的花蕾。

上述花蕾的花冠高于花萼0-2mm。

上述大豆花的柱头上滴加基因转化液的步骤进行两次，两次间隔时间为2小时之内。

上述方法还包括在所述收获种子步骤之后进行种子萌发得到转基因大豆植株。

上述方法还包括所述种子萌发后的筛选，所述筛选包括如下步骤：在所述种子出苗后从真叶完全展开至第1三出叶展开之前，在叶面上喷洒除草剂。