[发明专利]甜(辣)椒未成熟小孢子直接诱导萌发成植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种甜(辣)椒未成熟小孢子直接诱导萌发成植株的方法。

背景技术

甜(辣)椒(Capsicum annuum L.)属茄科一年生草本植物，我国栽培面积最大的蔬菜作物之一。辣椒的杂种优势非常明显，为了提高辣椒的质量和产量，辣椒的育种工作对生产起着重要的作用。但传统的育种方式存在周期长、效率低等问题。通过花药或花粉培养获得大量单倍体植株，从而获得纯合二倍体植株，不仅大大加快了育种速度，而且显著地提高了选择效果，节省了大量的人力物力。花粉培养(游离小孢子培养)则更优于花药培养，花粉培养排除了药壁组织二倍体体细胞的干扰，获得的植株完全是由单倍体单细胞发育而来，同时也避免了嵌合体的发生，在通过自发或人工诱导染色体加倍后，能获得遗传上完全纯合的双单倍体(DH)。这种遗传稳定的材料，可用于杂交育种及种质资源的丰富和改良。

自从20世纪70年代烟草和曼陀罗小孢子培养成功获得单倍体植株以来的三十多年里，大白菜、油菜、大麦、小麦、水稻等作物的小孢子培养都获得了成功。油菜等作物的规模化双单倍体(DH)植株生产技术在育种上得到了很好的应用。但目前国内外对于甜(辣)椒游离小孢子培养获得植株的成功报道并不多见。Gonza′lez-Melendi等1996年，Regner 1996年，Mityko′和Fa′ri 1996年和1997年，Ba′ra′ny等2001年都报道了由辣椒游离小孢子获得胚状体的研究，并没有得到再生植株。U.Bal等在2003年，L..Biotechnology & Biotechnological Equipment，17(2)：38-43页曾报道用甘露醇饥饿、10℃预处理、无激素并添加17％蔗糖的NLN培养基得到了小孢子愈伤组织；直到2006年，Supena等在Plant Cell Reports，(25)1：1-10页报道了选用了10个印度尼西亚辣椒品种，用9℃低温、含有2％麦芽糖的双层Nitsch培养基培养辣椒花药，收集散落的小孢子，其中6个品种得到了胚状体并获得单倍体植株。但是最高频率平均10个花蕾只获得了1个正常植株；刘凡等在2007年，分子生物学报40(6)：371-379页报道从预培养15天的辣椒花药中机械游离小孢子细胞团，只获得了发育程度不同的各类胚状体；Kim等在2008年，.Plant Cell Reports，27：425-434页上报道用热激、蔗糖饥饿以及含有9％蔗糖的NLNS培养基等方法培养辣椒游离小孢子，建立了较高的胚状体发生率及完整的植株再生体系，共获得了55个胚状体，平均一皿(约含10X10⁴个花粉)获得5.5个胚状体，但实验只在辣椒的一个品种上获得成功。从上述报道可知，不同辣椒品种的游离小孢子培养方法差异非常大，从而说明了甜(辣)椒品种间基因型的差异对于小孢子培养有着的重要影响。而且游离小孢子培养成功获得再生植株的仅限于辣椒的几个品种。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供一种甜(辣)椒未成熟小孢子经诱导直接萌发成植株的培养方法。

本发明的技术方案如下：

甜(辣)椒未成熟小孢子直接诱导萌发成植株的方法，包括下述步骤：

(1)、无菌花药的获得：对小孢子处于单核靠边期或双核期的花蕾进行表面消毒，剥离花药；花蕾的选择方法是通过观察花蕾外部形态，挑选萼片和花瓣等长或花瓣稍长于萼片，并且内部花药尖端至1/3或1/2处微紫的花蕾；

(2)、无菌花药的预培养：将步骤(1)中的无菌花药置于改良固体R培养基中，4℃低温处理2～15天；对无菌花药进行低温预处理的目的在于：一方面有利于保持小孢子活力，另一方面由于花药已在固体培养基上培养了数天，在收集小孢子时，很容易挑选出状态好且没有污染的花药用于小孢子收集，从而保证了花药的质量；

(3)、小孢子的收集：取步骤(2)中预培养后的花药，置于改良液体R培养基中，挤压使小孢子游离，300目滤网过滤，离心收集小孢子；

(4)、小孢子的诱导培养：将步骤(3)获得的小孢子置于含蔗糖或麦芽糖3～15％、2，4-D浓度为0.1～0.5mg/L，KT浓度为0.5～1mg/L的液体R培养基中，在24～28℃下，黑暗或光照培养；

(5)、植株的获得：当步骤(4)中的小孢子经诱导形成胚状体后，分别按照下述(i)、(ii)、(iii)三种不同路径进行培养，得到正常植株；

(i)小孢子经诱导后形成的胚状体为鱼雷型或子叶型胚时，转至1/2MS培养基或含有浓度为1～3％蔗糖的1/2MS培养基中培养，得到正常植株；