[发明专利]IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及一种能作为酶标记抗体用于免疫测定的IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白，属于生物工程领域。

背景技术

碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)和辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)是酶免疫测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)中较为常用的免疫标记用酶。在ELISA中应用，AP系统的敏感性一般高于应用HRP系统，空白值也较低。但由于AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，因此国内在ELISA中一般均采用HRP。

碱性磷酸酶在免疫测定中作为标记用酶，是通过催化相应底物显色实现的。常用标记用酶的AP有两个来源，分别从大肠杆菌和小牛肠膜中提取，牛小肠碱性磷酸酶比活高达2000U/mg蛋白，大肠杆菌碱性磷酸酶比活40-60U/mg蛋白。大肠杆菌为原核生物而不能对蛋白质进行糖基化。序列分析表明AP活性中心Asp101-Ser102-Ala103序列高度保守。糖基化可能是影响其活性的重要因素，但并未得到证实。

目前，免疫酶标试剂制备方式是采用双功能试剂(如戊二醛，过碘酸盐等)将抗体与酶偶联，按以上方法制备的结合物一般混有未结合的酶和抗体。理论上结合物中混有游离酶不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过洗涤，非特异性吸附于固相上的游离酶已被洗去。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因而减低结合到固相上的酶标抗体量，故制备的结合物应予以纯化。因此，传统的抗体与酶的标记方式需要交联、纯化等多步蛋白质操作；而且偶联后往往存在蛋白质活性降低，抗体-酶结合物不均一，因而降低了检测的灵敏度。

利用基因工程技术生产免疫测定标记用酶，可改变从生物体分离提纯的生产方式，也是得到符合标记要求高纯度酶的一条新途径。而将标记酶直接与抗体融合表达的方式制备，可克服化学交联剂偶联方法的弊端。

理论上尽管将碱性磷酸酶与抗体融合表达，但目前研究主要集中在单链抗体(ScFv)与AP融合蛋白的构建，但是每检测一种抗原就要制备相应的融合抗体，在不能或不便构建抗体-酶融合蛋白时则融合标记受阻。因此，寻找一种可结合多种一抗的二抗并与酶以融合表达方式来制备免疫酶标试剂具有重要意义。

IgG抗体亲和肽是来自葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A，SpA)的ZZ结构域。SpA为金黄色葡萄球菌细胞壁的单链多肽，分子量为42kD，能通过疏水作用结合人、兔等多种动物IgG的Fc段，且这种结合不影响IgG的Fab段与抗原特异性结合的免疫活性，根据SpA这一特性，SpA不仅用于免疫球蛋白和单克隆抗体的纯化，还被多种标记物(HRP，AP，FITC，胶体金等)偶联标记用于免疫测定；因SpA与IgG结合不受种属限制，被称为“广泛二抗”。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种无需再次标记即可用于酶免疫测定的IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白(IgG affibody-Alkaline Phosphatase fusion protein，简写IgG Ab-AP)。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白，是IgG抗体亲和肽和碱性磷酸酶构成的融合蛋白，其一经产生即具有与IgG抗体的结合活性和AP催化活性，且二者标记比例为1∶1；该融合蛋白的酶比活力为386±82U/mg；与兔IgG抗体的亲和常数Ka≌6.7×10⁷L·mol^-1。

本发明的IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白的制备方法，步骤如下：

(1)将IgG抗体亲和肽基因和碱性磷酸酶基因连接，然后构建重组载体；

(2)电转化巴斯德毕赤酵母，选取重组载体整合到酵母基因组上的菌株；

(3)经G418抗性压力筛选高拷贝表达菌株；

(4)培养菌株，诱导表达IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白；

(5)提取纯化IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白。

具体如下：