[发明专利]基于微纳光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像系统

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于微纳光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像系统，尤其是一种可以提供较大照明能量，并且对样品进行多方位照明成像的光激活定位显微成像系统。

背景技术

远场光学荧光显微镜具有非接触性、无损伤性及可探测样品内部等优点，其一直是生命科学中常用的观测工具。但是由于衍射极限的存在，即使用油浸物镜提高数值孔径，传统的宽场光学显微镜横向分辨率约为200nm，无法用于观察细胞内分子尺度的动态和结构特征。近年来，光激活定位显微成像技术利用光激活荧光蛋白特性以及单分子荧光成像的高定位精度突破了光学分辨率极限，达到了20nm的分辨率。

光激活定位显微成像的基本原理是利用低能量的激活光照射荧光蛋白，单次仅激活视野下稀疏的荧光蛋白，再使用激发光进行照射，此时仅处于激活态的荧光蛋白被激发发出荧光。通过控制激活光光强和激发光光强，实现每个衍射极限区域内每个时刻至多有一个荧光分子发光。对采集到的单分子信号进行高斯拟合，精确定位各单分子。当能精确定位这些分子后，用激发光长时间照射，直至所有激活的荧光蛋白被漂白。然后按照上述步骤进入下一次循环，利用激活光和激发光定位其他的荧光分子。当视野内的荧光蛋白都被漂白后就得到了视野内荧光蛋白精确的定位信息，然后将这些荧光蛋白叠加在一张图中即得到了比传统光学显微成像分辨率高约10倍的超分辨显微图像。

根据光激活定位显微成像技术的成像原理，其探测到的是单个荧光蛋白分子发射的光强信号。单个荧光蛋白分子的信号很微弱，容易受到背景噪声的影响。然而探测到的单分子信号的信噪比直接影响分辨率，更高的信噪比可以得到更高的分辨率。

全内反射产生的倏逝场在轴向上只存在于百纳米的范围内，并且场强随着距离的增加呈指数衰减。利用倏逝场进行照明时，只有百纳米范围内的荧光蛋白被激活激发，而超过这个范围内的荧光蛋白则不受影响，其可以提供更高的信噪比。所以在一般的光激活定位显微成像系统中，利用全内反射产生的倏逝场进行照明，以减少背景噪声对分辨率的影响。

现有的光激活定位显微成像系统一般利用大数值孔径物镜产生倏逝场进行照明，其缺点是：1)大数值孔径增加了系统的成本；2)照明光路和探测光路重合，不易于调节光路；3)根据全内反射原理，只能探测贴壁生长的细胞的下表面，而无法探测具有生物功能的细胞上表面和侧面。

发明内容

本发明针对上述现有技术存在的不足，结合微纳光纤技术，设计了一种基于微纳光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像系统，可以提供较大照明能量，并且能对样品进行多方位照明成像。

本发明的技术方案为：

基于微纳光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像系统，主要由激活激光器11、成像激光器12、中性滤光片(9，10)、快门及其控制器(7，8)、反射镜6、二色镜5、透镜4、微纳光纤倏逝场照明器1、三维微纳调节架3、微纳光纤探针2、倒置荧光显微镜14、子倍增EMCCD探测器13组成；激活激光器11发射的激活激光依次经过中性滤光片10、快门及其控制器8、反射镜6、二色镜5、透镜4入射到微纳光纤倏逝场照明器1；成像激光器12发射的成像激光依次经过中性滤光片9、快门及其控制器7、二色镜5、透镜4入射到微纳光纤倏逝场照明器1；微纳光纤探针2安装在三维微纳调节架3上，微纳光纤倏逝场照明器1的微纳光纤段放置在倒置荧光显微镜14的样品池15内，用微纳光纤探针2拨动微纳光纤倏逝场照明器1从而调节微纳光纤倏逝场照明器1的位置，电子倍增EMCCD探测器13采集倒置荧光显微镜14的物镜收集到荧光信号。激活激光器11用于发出激活激光，根据使用的荧光蛋白的激活波段选用适当波长的激活激光器；成像激光器12用于发出成像激光，根据使用的荧光蛋白的激发波段选用适当波长的成像激光器；中性滤光片10用于控制激活激光的强度；中性滤光片9用于控制成像激光的强度；快门及其控制器8用于控制激活激光的照射时间；快门及其控制器7用于控制成像激光的照射时间；反射镜6用于改变激活激光的传播方向；二色镜5对上述激活光透射，二色镜5对上述成像光反射，并且将上述激活光和成像光的传播方向调节至一致；透镜4用于将激活光和成像光耦合入微纳光纤倏逝场照明器；微纳光纤倏逝场照明器1用于传导上述激活光和成像光，同时产生倏逝场对样品进行激活激发；通过控制三维微纳调节架3来调节微纳光纤探针2的三维位置，从而控制上述微纳光纤倏逝场照明器1在样品池内的位置、深度和角度；探测器电子倍增EMCCD13用于采集倒置荧光显微镜14的物镜收集到荧光信号。