[发明专利]一种利用颠茄外植体诱导胚性细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特指一种利用颠茄(Atropa belladonna L .)无菌苗诱导胚性细胞以及胚性细胞再生植株的方法。 

背景技术

东莨菪碱（scopolamine，C₁₇H₂₁O₄N）和莨菪碱（hyoscyamine，C₁₇H₂₃O₃N）（其外消旋体为阿托品）均为莨菪烷类生物碱（Tropane alkaloids，TAs是），是在临床上广泛使用的两种重要的基本药物。主要用于镇痛、麻醉、抗晕动药、治疗帕金森症、改善微循环、戒毒脱瘾、治疗农药中毒等，市场需求十分巨大。随着TAs是新功能的不断开发，其需求还在迅速增长。TAs是主要从茄科植物颠茄（Atropa belladonna）、天仙子（Hyoscyamus niger）、曼陀罗（Datura stramonium）中提取，产量有限。其中颠茄是TAs是最主要的商业栽培药源，我国药典规定的唯一TAs是是药源植物。

体细胞胚胎发生是体细胞向胚胎发生途径转变的发育再建过程，也是植物全能性预言的最好说明。体细胞胚发生现象被看作是开展生物学理论研究的良好模型。研究颠茄体细胞胚发生对于阐明植物发育的分子机理，促进中草药的遗传工程改良，无论在基础理论还是在实际应用价值上都具有极其重要的意义。

通过颠茄胚性再生植株，可以快速大量繁殖颠茄脱毒苗，胚性细胞也可创造、筛选优良无性系，获得TAs是含量相对较高而稳定的植株，也可作为转基因的受体培育高产转基因颠茄，为TAs是的生产提供优质新型药源，目前除了本实验室的研究成果外，尚无相关报道。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种利用颠茄外植体诱导胚性细胞以及胚性细胞再生植株的方法。通过建立适合颠茄的胚性细胞悬浮培养体系，该体系通过体细胞胚胎发生途径再生植株，达到以颠茄胚性细胞为受体，建立快速、高效的转基因颠茄以及利用胚性细胞突变筛选优良无性系的目的。

本发明是这样实现的：

一种以颠茄胚性细胞为受体的遗传转化方法，其以颠茄茎尖或侧芽、种子为材料，以附加2,4-D 3.0mg/L的MS固体培养基（MSA）诱导胚性细胞；胚性细胞的扩繁继代：将胚性细胞在以附加2,4-D 2.0mg/L的MS固体培养基（MSB）上筛选、继代培养。在附加2,4-D 2.0mg/L、0.2mg/mL 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、2.2g/L KCl、40g/L蔗糖的MS液体培养基（LMS）上悬浮培养；最后将胚性细胞在MS培养基上再生完成植株重建。胚性细胞可用作转基因的优良受体以及使用遗传物质诱变剂处理的受体。

具体包括：

1）颠茄无菌外植体的获得

利用颠茄成熟叶片、茎段或种子，消毒处理后接种后于MS培养基，光照培养，获得材料，适时继代，继代时将其剪成带有两片展开叶的节段接种。

2）胚性细胞悬浮培养体系的建立

剥取颠茄茎尖或侧芽分生组织，以及种子消毒灭菌后突破种皮的胚切成数段后，接种于附加2,4-D 3.0mg/L的MS固体培养基（MSA）中，光照培养，4-6周后，即可获得胚性细胞。在Nikon SMZ800体视显微镜下，放大观察，筛选诱导出来的典型胚性细胞，在附加2,4-D 2.0mg/L的MS固体培养基（MSB）上纯化保存、扩繁，每月一次。

3）胚性细胞的液体培养

胚性愈伤在扩繁6-8周后，将胚性愈用筛网破碎成均匀的小细胞团，转移到加有适当体积的附加2,4-D 2.0mg/L、0.2mg/mL 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、2.2g/L KCl、40g/L蔗糖的MS液体培养基（LMS）中悬浮培养，3-10d继代一次，细胞团较大时用0.5mm筛网进行破碎。

4）植株再生

将胚性愈伤细胞再转移至MS固体培养基上，25℃光照（16L/8D）筛选培养。在2-6周间将平皿上出现愈伤变绿，每月转移到新鲜MS固体培养基上继续再生，体胚会逐渐成熟，最终形成丛生芽和小植株。

在本发明中，获得的胚性细胞可用于脱毒苗，也可以利用遗传物质诱导突变产生新的新品系，也可以作为转化受体获得了高产TAs是的颠茄转化子，为TAs是的生产提供了一种新型优质的可持续使用的药源。

具体实施方式