[发明专利]一种用于大熊猫亲子鉴定的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因鉴定试剂盒，特别是一种用于大熊猫亲子鉴定的试剂盒。

背景技术

大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)种群的小规模、再分配，以及非自然选择的危险，可能导致遗传变异的损失，现有的“多雄配一雌”的交配方式也会带来诸如亲子关系混乱、近亲繁殖等问题。应用遗传标记对大熊猫进行亲缘关系鉴定、遗传评估和监测已成为大熊猫保护生物学研究的重要课题。

微卫星(microsatellite)被认为是确定人和动物间相互关系以及群体遗传学研究的最有效的新型遗传标记，其中重复单位仅由2-7bp组成，又称为短串联重复序列(Short Tandem Repeat，STR)。目前用于大熊猫亲子鉴定的微卫星标记主要有：张亚平等(1996)开发的8个gp系列引物；LüZhi等(2001)开发的18个Ame系列引物。本实验室与英国利物浦大学合作，采用Dynal磁珠富集技术，曾获得20个CD系列引物(沈富军等，2005)。这些研究为大熊猫的亲子鉴定和谱系管理奠定了坚实的基础。但是，上述微卫星标记没有经过系统的群体遗传学检测和评估，质量参差不齐：许多微卫星标记具有较高的突变率，还容易出现多重扩增、假扩增、零扩增等现象，给基因分型带来种种困难。

为了提高亲子鉴定的准确性，国际法庭遗传学会(International Society forForensic Genetics，ISFG)DNA委员会要求：微卫星分型必须要将清晰的等位基因Ladder(梯度标准物)作为参照标准。由于等位基因Ladder制备依赖于数据库的规模和质量，因此，欧美法庭已经指定了一些他们认可的人类的等位基因数据库(如CODIS，Combined DNA Index System等)，并授权一些生物公司制备专门的等位基因Ladder(商业化试剂盒)来执行这些标准。在动物方面，狗、猫、牛、羊、猪以及马等宠物和家畜的商业化试剂盒也已经研制出来了(http://www.AppliedBiosystems.com)。但是，这些试剂盒却没有制备相应的等位基因分型标准物，而是使用传统的ROX-350或ROX-500来做基因分型。由于这些标准物尺度较大，不同批次、不同系统(如仪器差异、人员更换)的分型产物都非常容易出现系统误差。因此，这些试剂盒仍处于试用阶段，并不能真正用于诊断。并且，在野生动物方面，目前还没有研制微卫星亲子鉴定试剂盒的报道。

发明内容

本发明的主要目的是针对上述现有技术中动物用亲子鉴定试剂盒不足以及对于大熊猫亲子鉴定的需求，提供一种用于大熊猫亲子鉴定的试剂盒：具有稳定的可作为分型标准物的等位基因，并且优化了PCR参数，这些分型标准物与各基因座的等位基因之间存在明确的一一对应关系，可以非常准确地进行微卫星分型。等位基因的命名按照ISFG等位基因命名法则进行甄别和命名的，也为形成学术规范、易化各单位间的交流奠定了基础。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于大熊猫亲子鉴定的试剂盒，主要由至少一组分型标准物、引物、PCR反应各组分、阳性对照DNA和容器组成，所述的分型标准物包含序列表所列的大熊猫11个STR基因座的68个等位基因。

68个等位基因的命名是按照ISFG等位基因命名法则进行的。

从2001年到2009年，发明人用前期研究(《Dynal磁珠富集大熊猫微卫星标记》，遗传学报，2005.5)(《Microsatellite variability reveals the necessity forgenetic input from wild giant pandas(Ailuropoda melanoleuca)into thecaptive population》，Molecular Ecology，2009(18)，1061-1070)(《Di-，tri-andtetranucleotide microsatellite loci for the giant panda(Ailuropodamelanoleuca)》，Molecular Ecology Notes2007(7)，1268-1270)得到的47个大熊猫微卫星标记多次进行了大熊猫亲子鉴定和种群遗传分析，获得大量数据。对这些数据进行整理、合并、筛选和重复实验，建立了个体数达110只的大熊猫微卫星数据库。