[发明专利]一种用于检测转基因大豆的锁式探针及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因产品的检测，特别是涉及一种基于锁式探针的滚环扩增与基因芯片相结合的转基因大豆检测方法。

背景技术

1983年第一例转基因作物(Genetically Modified Organism，GMO)面世，标志着人类利用基因工程技术改良作物的开始。转基因作物在抗虫、抗病害、抗除草剂及品质改良方面较常规育种周期更短，更具备优势，产生巨大的经济效益，商业种植面积迅速增加。随着转基因作物的在全球内种植比例不断升高，其安全性也受到广泛关注。各国都对转基因作物在环境安全、对人体健康影响、标签贴示及知识产权方面给予重视。转基因大豆在转基因作物中种植面积最广，而Round up ready(RRS)在转基因大豆中所占比例最高。

国内外研究者对转基因大豆Round up ready的检测方法都进行了大量的研究，主要采用多重PCR，多重实时荧光PCR、PCR-基因芯片等检测方法。传统的多重常规PCR检测方法在平台扩展方法具有一定的局限性，随着待检目标的增加，需要对体系中的每套引物的用量及比例重新进行优化，并且兼顾扩增效率等因素，工作量较大。而多重实时荧光PCR虽然在检测灵敏度等方面较多重常规PCR检测方法有优势，但是由于目前仪器自身及荧光染料研制的限制，仅能同时提供互不干扰的4个荧光通道，也限制了该技术在检测通量扩展。常规的多套PCR-基因芯片检测方法，需要多套引物进行扩增，操作步骤繁琐，并不适合大规模的高通量检测。

1994年Nilsson在《Science》杂志报道的Padlock Probe(简称PLP，中文译名锁式探针)，给多重检测方法提供新的选择，带来了革命性的改变(Nilsson et al.，1994)。锁式探针是长约55-130个碱基的单链DNA。PLP主要由5部分组成：特异性5’端检测区T1(5’带有PO4基团)、通用扩增引物P1、通用扩增引物P2、特异性标签(Zip)、特异性3’端检测区T2。在滚环扩增中利用一对通用引物可以实现对多条探针的同时扩增，并且通过固定在基因芯片上的与锁式探针中Zip标签互补的cZip对滚环扩增产物进行杂交及信号分析，该方法对多重目标进行检测只需更换其中的检测臂区和Zip标签，完全避免了多重PCR检测的每条引物浓度比例等优化调节，并且降低了引物之间的互相竞争，使基因芯片检测不再受到常规多重PCR的限制，实现了真正意义的高通量检测。

发明内容

本发明的目的是针对目前转基因大豆多靶标检测中存在的问题，提供一种特异性好的锁式探针。

本发明的另一目的是针对上述问题，提供一种基于上述锁式探针的操作简便、扩展性能好、灵敏、可靠的转基因大豆检测方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种用于转基因大豆检测的锁式探针，所述探针的序列从5’端到3’端依次包括T1、P1、P2、Zip、T2区段，所述T1和T2为与检测目标序列匹配的检测区域，P1和P2为通用引物结合区域，Zip为特异性标签，

所述T1含有Seq ID No.1所示序列，T2含有Seq ID No.2所示序列；

或者T1含有Seq ID No.3所示序列，T2含有Seq ID No.4所示序列；

或者T1含有Seq ID No.5所示序列，T2含有Seq ID No.6所示序列；

或者T1含有Seq ID No.7所示序列，T2含有Seq ID No.8所示序列；

Seq ID No.1：5’-CGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTG-3’

Seq ID No.2：5’-GATAAAGGAAAGGCCAT-3’

Seq ID No.3：5’-TTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAA-3’

Seq ID No.4：5’-TTCTTAAGATTGAATCCTG-3’

Seq ID No.5：5’-GGCACAAGGGATACAAACCCTTAATCC-3’

Seq ID No.6：5’-TGGCACAAATTAACAACAT-3’

Seq ID No.7：5’-TTTGGGTTCCCTATGTTTATTTTAACCTGTATGTATG-3’

Seq ID No.8：5’-CCACCTTCCTTTTCCA-3’。

所述锁式探针的Zip区段选自Seq ID No.9-12所示序列中的一条序列；