[发明专利]一种噬菌体层析法纯化方法

权利要求书

1.一种噬菌体层析法纯化方法，包括(1)扩增噬菌体、(2)富集噬菌体，得到噬菌体悬液，其特征在于：还包括如下步骤：

(3)柱层析：将步骤(2)富集得到的噬菌体经过柱层析后得到纯化后的噬菌体，其中柱层析的装柱材料为Sepharose 4B凝胶。

2.根据权利要求1所述的噬菌体层析法纯化方法，其特征在于：所述柱层析过滤后还经过树脂层析，所用树脂为DEAE-52树脂。

3.根据权利要求1所述的噬菌体层析法纯化方法，其特征在于：所述扩增噬菌体的步骤为：试管中过夜培养宿主菌，噬菌体来源为污泥，加入污泥样品或污水，扩大培养至对数期，混合培养，离心，去除大部分菌体及样品杂质，收集上清液，用0.22μm滤膜过滤除菌。

4.根据权利要求1所述的噬菌体层析法纯化方法，其特征在于：所述富集噬菌体的步骤为：在滤液中加入硫酸铵至终浓度为70％(w/v)，4℃静置，目的是使噬菌体颗粒沉淀，富集噬菌体，以10000g，20min离心，获得沉淀，70％硫酸铵重悬后得到菌悬液，在pH 7.4、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中透析，用双层平板法检测噬菌体数目，待用。

5.根据权利要求1所述的噬菌体层析法纯化方法，其特征在于：所述装柱材料为Sepharose4B凝胶的柱层析的步骤为：用pH 7.4，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液处理Sepharose 4B凝胶，Sepharose 4B凝胶是预溶胀的颗粒，脱气后装柱，用磷酸盐缓冲液充分平衡；取1mL噬菌体悬液上样，以磷酸盐缓冲液为洗脱液，以0.2mL/min流量洗脱，按照280nm紫外吸收曲线及洗脱体积收集。

6.根据权利要求2所述的噬菌体层析法纯化方法，其特征在于：所述装柱材料为DEAE-52树脂的柱层析的步骤为：DEAE-52树脂用蒸馏水溶胀后，按照碱-酸-碱顺序，分别用0.5mol/L的NaOH溶液和0.5mol/L HCl溶液分别处理30min，蒸馏水洗至中性；DEAE-52经pH 7.4，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液处理，脱气后装柱，用磷酸盐缓冲液充分平衡后；取5mL步骤(3)柱层析后样品上样，用0-1mol/L NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，按照280nm紫外吸收曲线及洗脱体积收集。

7.根据权利要求3所述的噬菌体层析法纯化方法，其特征在于：所述0.1mol/L磷酸盐缓冲液的配置方法为：将95mL 0.2mol/L NaH₂PO₄与405mL 0.2mol/L Na₂HPO₄混合，定容至1000mL。

8.根据权利要求4所述的噬菌体层析法纯化方法，其特征在于：所述0.5mol/L氢氧化钠液：称取20g固体NaOH，溶于蒸馏水中，冷却后，定容至1000mL。

9.根据权利要求1所述的噬菌体层析法纯化方法，其特征在于：所述噬菌体包括铜绿假单胞菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体或鲍曼不动杆菌噬菌体。