[发明专利]一种检测土壤微生物多样性的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物分析的方法，尤其涉及一种检测土壤微生物多样性的分析方法。

背景技术

目前，对土壤微生物的研究主要是借助了分子生物学的手段，直接从土壤中获得微生物的宏基因组DNA进行分析，该策略使环境微生物多样性分析成为一种尽可能全面的方法。近年来，关于土壤宏基因组DNA提取方法的报道很多。然而主要侧重于提取土壤中细菌群落的总DNA的提取，较少关注土壤中真菌群落总DNA的提取及其提取效果。来自环境中的样品含有非常复杂的成分，尤其是土壤中的腐质酸类物质在提取过程中不能去除掉，直接影响后续的PCR扩增。所以大多数方法初提的DNA都要经过回收纯化，然而回收的过程或多或少的会损失部分DNA，尤其是大片段的DNA回收率比较低，有人利用通过透析袋回收纯化，纯化回收率只能够达到65.34％，仍然丧失了一部DNA，对于实际上存在量本来就少的微生物种类后续的检测中就很难检测到，因而不能真实地反土壤微生态结构。因此，如何减少提取以后的DNA损失是有待于解决的问题。

发明内容

本发明为了解决以上的问题而提出一种检测结果清确度高的检测土壤微生物多样性的分析方法，其技术方案如下：

一种检测土壤微生物多样性的分析方法，包括以下步骤：(1)从土壤中进行DNA提取；

(2)对步骤(1)中的DNA提取液中测出土壤中的DNA的浓度和纯度；

(3)将土壤中提取的DNA进行PCR特异性扩增；

(4)PCR反应产物的变性梯度凝胶电泳分析。

如上所述的一种检测土壤微生物多样性的分析方法，其中提取DNA的条件如下：称土样于离心管中，加提取液涡旋混匀后置于冰箱静止或液氮速冻，取出水浴融化，反复冻融，加蛋白酶K，摇床振荡，加SDS，水浴在室温离心，收集上清，尽可能的不要取到上清与土壤沉淀之间的杂质，沉淀加提取液和20％SDS，涡旋水浴一定的时间，室温下离心，合并上清；上清中加聚己二醇800混匀，沉淀过夜；然后离心，弃上清，沉淀加入1×TE溶解；用等体积的氯仿：异戊醇抽提，离心后收集上清，重复一次；用NaAc和异丙醇室温沉淀，离心后弃上清；沉淀用70％乙醇洗涤，离心后弃上清，晾干，加超纯水溶解。

如上所述的一种检测土壤微生物多样性的分析方法，其中步骤(2)中的检测方法为：取所提取的DNA，0.7％琼脂糖检测，以λmixl9(Fermentas)为Maker，用紫外分光光度计测定DNA的OD₂₆₀、OD₂₃₀、OD₂₆₀/OD₂₃₀的值及DNA的纯度。

如上所述的一种检测土壤微生物多样性的分析方法，其中在步骤(3)中的PCR仪反应条件为：反应总体积为20μL：模板DNA 1ng，PCR buffer 2μL，Mg²⁺2μL，引物(10μM)各0.2μL，BSA(10mg/mL)2μL，dNTPs(各10mM)0.3L，Taq酶(5U/L)0.2μL，ddH₂O补齐至20μL。长片段扩增应程序：94％4min；94℃40S，46℃40S，72℃40S，共循环38次72℃延伸10min；4℃保存；

取上述的一次扩增产物1μL，PCR buffer 5μL，Mg²⁺5μL，引物(10μM)各0.5μL，dNTPs(各10mM)0.7μL，BSA(10mg/mL)2μL，Taq酶(5U/μL)1μL，ddH₂O补齐至50μL。采用降落式PCR反应程序：94℃4min；94℃30S，63℃30S，72℃30S，共循环15次；94℃30S，63℃30S(每循环1次下降1)，72℃30S，共循环13次；94℃30S，52℃30S，72℃30S；72℃延伸7min；4℃保存。扩增产物利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，DL2000作为Marker；