[发明专利]转基因陆生植物在富养化水体修复中的用途

说明书

技术领域

本发明属于生物聚磷技术领域，涉及一种利用转基因陆生植物进行富养化水体可溶性磷去除的方法，用于磷的高效生物去除，以及富磷的生物污水处理，富养化水体的生物修复和生物净化。

背景技术

我国是一个水资源非常贫乏的国家，淡水资源总量约为28000亿立方米，人均占有量约为2300立方米，仅为世界平均水平的1/4，在世界排第110位，是全球人均水资源最奇缺的国家之一。而日益严重的水污染又使用水形势更为严峻。黄河、长江、淮河以及海河四大流域的整体污染现状已经成为常态。7大水系中有26％水质为五类和劣五类，9大湖泊中7个是五类和劣五类。

目前我国水污染的主要形式为：过量磷含量造成的水体富养化，并由此引起的蓝藻等爆发；由于水体富营养化造成蓝藻爆发导致水体功能死亡的现象已从云南滇池扩散到全国各地的内陆湖泊，瘫痪着一个又一个美丽的水体，给本来就稀缺的水资源雪上加霜。

磷过量是富养化水体，尤其是内陆湖泊富养化的诱因。磷是藻类和水生植物的营养源，其含量通常决定着藻类的收获量，已有的研究表明，引起水体富营养化的各类营养物资中，通常以磷为限制因子。传统的生物除磷技术是采用好厌氧(A/O)和厌氧/缺氧/好氧(A/A/O)活性污泥，近年则开始采用以活性淤泥为基质的改进了的强化生物除磷(enhanced biological phosphorus removal，EBPR)，其除磷的主要原理是活性淤泥中的聚磷菌株将可溶性磷酸盐聚合为不溶性并集聚于菌体内的多聚磷。但活性淤泥和EBPR主要适用于污水处理厂进行污水的初步处理，很难用于磷引起的富养化天然水体的原位修复，其原因如下：(1)活性淤泥如直接投入天然水体，其富集的磷仍在淤泥中，很容易由多聚磷重新水解为磷酸盐，再次进入水体；(2)EBPR技术需要曝气和厌氧循环，这在天然水体是无法实现的；(3)聚磷菌本身聚磷能力有限，目前发现的所有聚磷菌内催化磷酸盐聚合为多聚磷的聚磷酶和催化多聚磷水解为可溶性磷酸盐的解磷酶组成了一个操纵子，该操纵子中的启动子为磷调控启动子，该启动子诱导所需磷浓度远远高于国家V类水标准中的磷浓度，因此诱发天然水体富养化的磷浓度很难启动聚磷酶基因的表达；同样聚磷酶与解磷酶的串联组成使得聚磷酶表达同时解磷酶同步表达，这导致聚磷和解磷动态平衡，很难在天然水体中进行磷的富集。因此通过转基因技术将相关聚磷基因等导入可以在水体悬浮培养而非水生动物饵料的植物是有效进行污染水体修复的重要途径，开展这方面的研究必将为有效修复污染水体，扩大可利用水资源、有效进行环境管理工作、提供技术支撑，具有巨大的社会和经济意义。

发明内容

本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供一种新型的水体去磷技术，该技术是利用整合聚磷酶基因的转基因陆生茄科烟草植株和蔷薇科草莓植株的水体漂浮培养和水体周围的种植来去除水体可溶性磷和防止或减少可溶性磷从陆地淋溶进入水体，实现水体可溶性磷含量的减少；本发明的另一目的为：提供应用本发明技术进行P污染的富养化水体的原位生物修复方法。

本发明的技术方案概述如下：

本发明提供一种利用转ppk基因的陆生植物的水面漂浮培养进行生物富集富养化水体可溶性磷的技术。

1，ppk基因的克隆：以申请者自有的聚磷菌(《中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心》，菌种保藏号为：CGMCCNo.1805)为目标菌株克隆完整的ppk基因。

2，通过亚克隆技术构建插入ppk基因的农杆菌质粒载体。

3，通过叶盘侵染法实现ppk基因对烟草、草莓的转化；通过植物组织培养技术完成转基因烟草、草莓的再生。

(1)将含有目标基因的植物表达载体转入农杆菌LBA4404中。

(2)挑取单菌落于YEB液体培养基中活化，过夜。

(3)取1ml菌液接种于50mlYEB液体培养基培养至OD值为0.8-1.0；

(4)5000rpm离心，6分钟，收集沉淀；

(5)将沉淀重悬于80mlYEB液体培养基中，此时农杆菌的OD值在0.5-0.6之间。

(6)将待侵染叶片放入无菌水中清洗；

(7)放入制备好的农杆菌侵染6-8分钟；

(8)滤纸吸干放入MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA，黑暗共培养2天(烟草)；滤纸吸干放入MS+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L 2.4-D，黑暗共培养3天(草莓)；